性激素結(jié)合球蛋白在妊娠期糖尿病胎盤組織中的變化及其意義

金鎮(zhèn)，孫磊，滕衛(wèi)平，張亞南，艾婉婷，王娉婷

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；2.遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110001）

性激素結(jié)合球蛋白在妊娠期糖尿病胎盤組織中的變化及其意義

金鎮(zhèn)1，孫磊1，滕衛(wèi)平2，張亞南1，艾婉婷1，王娉婷1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004；2.遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110001）

目的探討性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）在妊娠期糖尿?。℅DM）胎盤組織中的表達(dá)變化及其意義。方法 應(yīng)用RT-PCR、Western blot及ELISA法分別檢測(cè)GDM胎盤組織中SHBGmRNA、SHBG蛋白及SHBG濃度。結(jié)果 GDM組與對(duì)照組比較：SHBGmRNA（1.839±0.827vs 2.485±1.950）、SHBG 蛋白（1.852±0.645vs 2.522±0.842） 及 SHBG 濃度（2.071±0.417vs 2.495±0.529）都顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。結(jié)論GDM時(shí)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞存在著SHBG，但其合成和分泌減少，在GDM發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。

性激素結(jié)合球蛋白；妊娠期糖尿??；胎盤

性激素結(jié)合球蛋白（sex hormone binding globulin，SHBG）是一種能結(jié)合性激素甾體的球蛋白，主要由肝臟組織細(xì)胞合成和分泌，其基因編碼區(qū)位于第17對(duì)染色體的短臂（p12-13），由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，長(zhǎng)約3kb，并具有多態(tài)性，最近研究表明SHBG在胎盤等組織中有不同程度的表達(dá)，除能特異性的結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)性激素外，還具有介導(dǎo)激素信號(hào)傳導(dǎo)和類激素樣作用，并是糖尿病的危險(xiǎn)因素，在妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）發(fā)病中起重要的調(diào)節(jié)作用［1，2］。為此本文分別應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、 蛋 白 免 疫 印 跡（Western blot）及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）分別檢測(cè) GDM 胎盤組織中SHBGmRNA、SHBG蛋白及SHBG濃度的表達(dá)，以探討GDM時(shí)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞存在SHBG及其表達(dá)變化與GDM發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選取2008年10月至2010年10月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院住院，妊娠36～41周行擇期剖宮產(chǎn)的孕婦（本試驗(yàn)在孕婦知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)同意下進(jìn)行）60例，GDM組30例，依據(jù)美國(guó)糖尿病資料小組（national diabetes data group，NDDG）制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即葡萄糖負(fù)荷試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT），試驗(yàn)中空腹及服糖后 1、2、3h 血漿血糖水平中的2項(xiàng)分別達(dá)到或超過5.8mmol/L、10.6mmol/L、9.2mmol/L、8.1mmol/L。對(duì)照組 30例。兩組均無心、肝、腎和其他內(nèi)分泌疾病，無既往糖尿病及高血壓病史。剖宮產(chǎn)時(shí)胎盤娩出后，立即取臍帶附著處相對(duì)母體面1.0cm×1.0cm×1.0cm和0.5cm×0.5cm×0.5cm大小絨毛組織，冷生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干后用于RT-PCR者液氮速凍4h后-80℃保存。

1.2 主要試劑

山羊抗人SHBG多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），SHBG ELISA試劑盒（美國(guó)R&D公司）。RNA引物由美國(guó)Invitrogen英杰生命技術(shù)公司合成，TRIzol（Invitrogen）和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR相關(guān)試劑均購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 RT-PCR法

按照試劑盒說明從冷凍組織中提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增SHBG及內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）基因片段。SHBGcDNA上游引物是exonVII591-610，序列為5′TGTAGAATCAAATCCCGGGA 3′，下游引物是exonV790-809，序列為 3′TTCCACCACAACAGAAG ACC 5′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為219bp；β-actin上游引物為 5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3′，下游引物為3′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC 5′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 498bp。SHBGPCR反應(yīng)體系為SHBGc DNA 3μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，SHBG 上游、下游引物各0.5μL，10×PCR 緩沖液 2.5μL，Taq 酶（5U/μL）0.2μL。內(nèi)參反應(yīng)體系為 β-actincDNA 3μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，β-actin 上游、下游引物各 0.1μL，10×PCR 緩沖液 2.5μL，Taq 酶（5U/μL）0.2μL。SHBG反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：42℃65min→95℃5min→40次循環(huán)（94℃ 40s→60℃ 1min→72℃ 1min）；β-actin反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：42℃65min→95℃5min→35次循環(huán)（94℃40s→55.5℃1min→72℃1min）取8μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下檢測(cè)特異性條帶；外掃描儀掃描，通過計(jì)算條帶面積獲得吸光度（A）。以SHBG條帶A值與內(nèi)參照βactin條帶A值的比值來表示mRNA的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.4 Western blot法

標(biāo)本中加入裂解液，超聲勻漿后，4℃12000r/min離心。上清用BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。每份上清液取20μL加樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫下封閉緩沖液2h，一抗 SHBG（1∶200，山羊抗人多克隆 IgG，Santa Cruz公司）或GAPDH 4℃過夜。二抗用辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG（1∶3000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）室溫90min。洗膜后加入ECL 1min。凝膠成像分析軟件條帶灰度分析，讀取IOD值以SHBG蛋白的IOD值/GAPDH的IOD值半定量RNA蛋白的水平。

1.5 ELISA法檢測(cè)SHBG

稱重組織加入定量PBS，勻漿后4℃3000r/min離心20min。各組取10μL加入設(shè)定的孔中，按ELISA試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀450nm處以空白對(duì)照孔調(diào)零，直接測(cè)定吸光度（OD值），并由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成SHBG的濃度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，SHBG mRNA、SHBG RNA蛋白及SHBG濃度比較應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SHBG的RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

SHBGmRNA在GDM胎盤組織較對(duì)照組的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。

2.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果

人胎盤中可檢測(cè)出SHBG蛋白條帶，并且在GDM中表達(dá)量明顯小于對(duì)照組，灰度值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖 2。

2.3 SHBGmRNA、SHBG蛋白及SHBG濃度在兩組胎盤組織中的變化

GDM組與對(duì)照組比較：SHBGmRNA、SHBG蛋白及SHBG濃度都顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表 1。

表1 SHBGmRNA、SHBG蛋白及SHBG濃度在兩組胎盤組織中的變化（±s）Tab.1 The change of SHBG mRNA、SHBG protein and SHBG concentration in both groups ofplacentaltissue（±s）Group n SHBGmRNA（IOD） SHBG protein（IOD） SHBG（nmol/L）GDM 30 1.839±0.827 1.852±0.645 2.071±0.417Control subject 30 2.485±1.950 2.522±0.842 2.495±0.529

3 討論

SHBG是一種由肝臟合成的循環(huán)類固醇結(jié)合糖蛋白，它與雄激素的結(jié)和力較雌激素高，當(dāng)SHBG濃度發(fā)生明顯變化時(shí)，對(duì)體內(nèi)雌、雄激素均有明顯影響，使體內(nèi)雄激素/雌激素相對(duì)平衡比值發(fā)生異常。SHBG受胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）、性激素、甲狀腺素的調(diào)節(jié)。其中胰島素是其代謝的重要調(diào)節(jié)激素，當(dāng)胰島素敏感性降低，胰島素代償性分泌增加，胰島素水平升高，可使肝臟SHBG合成減少［3］。目前認(rèn)為低SHBG是2型糖尿病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是高胰島素血癥性胰島素抵抗的一個(gè)標(biāo)志［4～6］。尤其在妊娠期間，性激素對(duì)SHBG的調(diào)節(jié)是有限的，胰島素成為重要的調(diào)節(jié)因素［7，8］。Bartha等［9］于2000年首次報(bào)道GDM婦女血清SHBG減少。Smirnakis等［1］也研究表明早孕非空腹SHBG似乎是最佳的指標(biāo)來預(yù)測(cè)隨后的妊娠糖尿病。Thadhani等［10］研究表明從孕早期開始血清SHBG的濃度減低的婦女在孕晚期發(fā)展為GDM的概率增加，SHBG可以作為GDM預(yù)測(cè)的一個(gè)標(biāo)志。我們?cè)芯勘砻髋c正常孕婦比較，GDM早孕時(shí)血清SHBG就降低，GDM 發(fā)病時(shí)降低明顯［11，12］。

近年來研究表明SHBG除了存在于肝臟還存在于不同的性甾體激素靶組織如睪丸、前列腺、卵巢、子宮內(nèi)膜、乳腺甚至心臟，人胎盤組織及體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞中也存在SHBG的表達(dá)和分泌［13］。GDM時(shí)胎盤SHBG變化非常值得探討，但尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GDM與正常孕婦胎盤中均存在SHBG及 SHBGmRNA，GDM組與對(duì)照組比較SHBGmRNA、SHBG蛋白及SHBG濃度都顯著降低，說明GDM時(shí)胎盤合成和分泌SHBG減少。胎盤內(nèi)SHBG減少可能與肝臟分泌減少機(jī)制相似，由于血中高胰島素水平抑制了胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞SHBG的自分泌或旁分泌從而導(dǎo)致SHBG減少，GDM時(shí)胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞損傷也導(dǎo)致了合成和分泌SHBG減少，因此GDM胎盤組織中SHBG表達(dá)比正常胎盤組織中顯著減少。

GDM時(shí)胰島素抵抗的增加和胰島β細(xì)胞分泌的降低導(dǎo)致了循環(huán)血SHBG的減少，而胎盤合成和分泌SHBG減少的原因有待于進(jìn)一步深入研究。

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（編輯裘孝琦，英文編輯劉寶林）

Expression Changes of Sex Hormone Binding Globulin in GDM Placental Tissue and Its Significance

JIN Zhen1，SUN Lei1，TENG Wei-ping2，ZHANG Ya-nan1，AI Wan-ting1，WANG Pin-ting2
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004；2.Liaoning Provincial Key Laboratory of Endocrine Diseases，Shenyang 110001）

ObjectiveTo explore expression changes of sex hormone binding globulin in GDM placental tissue and its significance.MethodsDetectingSHBGmRNA，SHBG protein and SHBG concentration in GDM placental tissue respectively used RT-PCR，the Western blot and ELISA.ResultsGDM group compared with controls：SHBGmRNA（1.839±0.827vs 2.485±1.950），SHBG protein（1.852±0.645vs 2.522±0.842）and SHBG concentration（2.071±0.417vs 2.495±0.529）were significantly reduced（P<0.05）.ConclusionSHBG exist in GDM placental nourish cells but its synthesis and secretion were reduced.This played an important role in the pathogenesis of GDM.

sex hormone binding globulin；gestational diabetes mellitus；placenta

R714.25

A

0258-4646（2011）05-0446-03

doiCNKI：21-1227/R.20110523.1814.013

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20110523.1814.013.html

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20042089）；遼寧省教育廳高?？蒲杏?jì)劃（20062013）

金鎮(zhèn)（1963-），男，教授，博士.E-mail：jinzhen66@yahoo.com.cn

2010-12-30

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2011-05-1815：25