碳纖維增強(qiáng)碳與碳化硅雙基體陶瓷基復(fù)合材料作為口腔種植體材料的細(xì)胞毒性

方鐵鈞，周群，狄麗莎，譚兆軍，鄧景屹

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院口腔科，沈陽 110004；2.中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院兒童牙科，沈陽110002；3.中國科學(xué)院金屬研究所，沈陽 110016）

碳纖維增強(qiáng)碳與碳化硅雙基體陶瓷基復(fù)合材料作為口腔種植體材料的細(xì)胞毒性

方鐵鈞1，周群1，狄麗莎2，譚兆軍1，鄧景屹3

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院口腔科，沈陽 110004；2.中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院兒童牙科，沈陽110002；3.中國科學(xué)院金屬研究所，沈陽 110016）

目的通過體外細(xì)胞培養(yǎng)法評價碳纖維增強(qiáng)碳與碳化硅雙基體陶瓷基復(fù)合材料（C/C-SiC）對細(xì)胞生長和凋亡的影響。方法 用實驗材料不同濃度浸提液培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞L929，采用MTT法檢測細(xì)胞的相對增殖度；采用急性溶血試驗檢測材料對血細(xì)胞的溶血作用，計算溶血率；采用流式細(xì)胞儀、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測陰性對照組、100%C/C-SiC組、純鈦組、陽性對照組的細(xì)胞散點(diǎn)圖，計算正常細(xì)胞、早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞的比例。結(jié)果 C/C-SiC復(fù)合材料的細(xì)胞毒性為1級，溶血率為0.156%，無明顯溶血反應(yīng)，與陰性對照組和純鈦組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。C/C-SiC組4個象限細(xì)胞比例與純鈦組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），陽性對照組的早期凋亡、正常細(xì)胞比例與其他任一組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 C/C-SiC復(fù)合材料有生物安全性基礎(chǔ)，無細(xì)胞毒性，無溶血反應(yīng)。

細(xì)胞毒性；溶血反應(yīng)；MTT；成纖維細(xì)胞L929；復(fù)合材料；凋亡

目前口腔種植體材料大部分是鈦和鈦合金材料，金屬種植體本身的缺點(diǎn)是與骨組織的彈性模量相差較大，易形成應(yīng)力集中和骨吸收。碳纖維復(fù)合材料如碳纖維增強(qiáng)碳基體復(fù)合材料（C/C），由于碳元素有優(yōu)異的生物相容性能，具有與人體骨非常接近的彈性模量［1，2］，能有效減少應(yīng)力屏蔽效應(yīng)導(dǎo)致的骨吸收［3］，而且材料具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)和高強(qiáng)度的機(jī)械性能，是一種潛在的骨修復(fù)和替代材料。但是C/C復(fù)合材料長期置于體內(nèi)，其游離出來的碳顆粒會沉積到皮膚，造成“黑膚效應(yīng)”［4］。C/C-SiC是以C/C為胚體，用化學(xué)氣相滲透技術(shù)把SiC基體通過氣相滲透而制得。C/C-SiC克服了C/C碳顆粒易脫落易氧化的缺點(diǎn)，具有更出色的各種性能。C/C-SiC作為生物醫(yī)學(xué)材料的應(yīng)用研究還未見報道。本研究采用中國科學(xué)院金屬研究所提供的C/C-SiC，利用體外細(xì)胞毒性手段，初步探究該材料作為口腔種植體材料的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

C/C-SiC、純鈦、純鉛（中國科學(xué)院金屬研究所），L929小鼠成纖維細(xì)胞（中國醫(yī)科大學(xué)實驗技術(shù)中心），Annexin V-FITC/PI、MTT、DMSO（美國 Sigma 公司），IX70倒置顯微鏡（日本Olympus公司），酶標(biāo)檢測儀（奧地利Tecan公司），流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2 材料的制備與浸提液的提取

1.2.1 MTT法和Annexin V-FITC/PI雙染法浸提液提?。篊/C-SiC、純鈦、純鉛利用線切割技術(shù)制成5mm×5mm×2mm大小。取C/C-SiC片、純鈦片、純鉛片各30片，常規(guī)超聲波清洗，蒸餾水清洗，烘干后放入75%乙醇浸泡24h，濾紙上干燥，紫外線正反面各照射30min后置于浸提容器內(nèi)，按樣本表面積與浸提液比例為3cm2/mL加入RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃恒溫器浸提72h。

1.2.2 溶血試驗浸提液提?。簩/C-SiC片、純鈦片常規(guī)清潔，高溫高壓蒸汽消毒，干燥，按材料量與無菌生理鹽水之比為5g/10mL的標(biāo)準(zhǔn)，每個試管加入10mL生理鹽水，生理鹽水全部覆蓋材料（C/C-SiC組n=3，純鈦組n=3），同時設(shè)置對照組，每個試管10mL無菌生理鹽水作為陰性對照組（n=3），每個試管10mL蒸餾水作為陽性對照組（n=3），共4組。將所有組置于37℃恒溫水浴浸提30min后分別收集于無菌離心管中，放4℃冰箱保存。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT法：將L929小鼠成纖維細(xì)胞經(jīng)3次傳代后取對數(shù)生長末期細(xì)胞，用0.5%胰蛋白酶消化，配制成2×104/mL的細(xì)胞懸液，取5塊96孔培養(yǎng)板，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。吸除原培養(yǎng)液，每孔分別加入100μLRPMI1640液（陰性對照組）、鉛浸提液（陽性對照組）、純鈦浸提液（純鈦組）、100%、50%和 25%的C/C-SiC浸提液（100%C/C-SiC組、50%C/C-SiC組、25%C/C-SiC組），濃度用RPMI1640液稀釋控制，以沒有細(xì)胞只有RPMI1640液（空白對照組）作為調(diào)零孔，共7組，每組6孔，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24、48、72、96、120h后取出一塊板，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況，每孔加入20μLMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸除孔內(nèi)的培養(yǎng)液，加入200μLDMSO溶液，搖床上低速振蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的吸光度值（Optical density，OD），波長為 490nm，比較各組OD值的差異，計算細(xì)胞相對增殖率（relative growth rate，RGR），根據(jù)RGR判定材料的細(xì)胞毒性。RGR≥100%的細(xì)胞毒性等級為0級；75%～99%為1級；50%～74%為2級；25%～49%為3級；1%～24%為4級；＜1%為5級。評價標(biāo)準(zhǔn)是0、1級為合格；2級應(yīng)結(jié)合細(xì)胞形態(tài)評價；3、4、5級為不合格。

1.3.2 溶血試驗：每20mL新鮮兔全血中加入1mL2%（20g/L）草酸鉀生理鹽水溶液，調(diào)整生理鹽水用量，使稀釋后兔血0.2mL在10mL蒸餾水中在545nm 處的 OD值為（0.8±0.3），使用前配制，于 4℃冰箱儲存。每試管中加入抗凝兔血0.2mL，輕輕搖勻后置于37℃恒溫水箱中60min后各試管1500r/min離心5min，吸取上清液，在紫外分光光度計上于545nm波長測量OD值，計算溶血率。評判標(biāo)準(zhǔn)：溶血率＞5%時，可判斷材料具有溶血作用。

1.3.3 Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：取對數(shù)生長期末細(xì)胞，配制成1×106/mL的細(xì)胞懸液，取12孔培養(yǎng)板，每孔加入1mL細(xì)胞懸液，于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，吸除孔內(nèi)培養(yǎng)液，分別加入RPMI1640液（陰性對照組）、100%C/C-SiC浸提液（100%C/C-SiC組）、純鈦浸提液（純鈦組）、鉛浸提液（陽性對照組）1mL，共4組，每組6孔，培養(yǎng)48h后，吸除浸提液，胰酶消化細(xì)胞，加入1mL冷PBS，在 4℃、1000r/min離心10min，冷 PBS清洗 2次。將細(xì)胞重懸于400μL緩沖液，加入5μLAnnexin V-FITC輕輕搖勻，避光室溫下反應(yīng)15min，加入10μLPI，避光室溫反應(yīng)5min，1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測，選擇488nm氬離子激光源。觀察各組細(xì)胞流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖，計算各組正常、早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 L929細(xì)胞形態(tài)學(xué)

在倒置顯微鏡下觀察，24～120h陰性對照組、純鈦組、各濃度C/C-SiC組的細(xì)胞密度增加。120h時細(xì)胞長滿培養(yǎng)板底部，呈重疊狀態(tài)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，呈梭形或多角形，形態(tài)規(guī)則，核分裂相多見，僅見到個別細(xì)胞皺縮、變圓。24h時陽性對照組細(xì)胞數(shù)量少，且大部分細(xì)胞已皺縮，形態(tài)極不規(guī)則，細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞中可見顆粒樣物質(zhì)，120h時幾乎所有陽性對照組細(xì)胞已脫落死亡。見圖1。

2.2 MTT實驗結(jié)果

陰性對照組、純鈦組及25%、50%、100%C/CSiC組的OD值隨時間的推移逐漸增大，從96h開始細(xì)胞的增長進(jìn)入平臺期，而陽性對照組細(xì)胞的OD值隨時間的推移逐漸減少，至120h已基本達(dá)到空白對照組的OD值水平。見圖2。

隨著培養(yǎng)時間的增加，陰性對照組、純鈦組、25%、50%、100%C/C-SiC組的OD值也相應(yīng)增加，與培養(yǎng)時間成正線性關(guān)系，顯示細(xì)胞生長較快。陽性對照組隨著時間的增加OD值減少，表示細(xì)胞生長受到抑制及破壞。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，各時間點(diǎn)陽性對照組與其他組比較OD值的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），25%、50%、100%C/C-SiC組與陰性對照組和純鈦組比較、純鈦組與陰性對照組比較，OD值的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。純鈦組及25%、50%、100%C/C-SiC組細(xì)胞毒性為0或1級，表現(xiàn)出很輕微的細(xì)胞毒性，陽性對照組細(xì)胞毒性為2～4級，表現(xiàn)出很明顯的細(xì)胞毒性。見表2。

表1不同培養(yǎng)時間點(diǎn)各組的OD值（±s）Ta b.1ODv a l u e a t d i f f e r e n t c u l t u r e t i m e p o i n t s（±s）Gr o u p 24h 48h 72h 96h 120h Bl a n k c o n t r o l g r o u p 0.139±0.009 0.166±0.009 0.207±0.037 0.197±0.021 0.231±0.034Ne g a t i v e c o n t r o l g r o u p 0.696±0.0361） 0.848±0.0371） 0.921±0.0321） 1.231±0.1751） 1.205±0.1021）Po s o t i v e c o n t r o l g r o u p 0.516±0.025 0.394±0.015 0.379±0.033 0.415±0.036 0.324±0.016Ti t a n i u m g r o u p 0.690±0.0241） 0.768±0.0501） 0.862±0.1111） 1.241±0.0831） 1.202±0.1031）25%C/C-Si Cg r o u p 0.691±0.0371） 0.793±0.0561） 0.768±0.0601），2） 1.248±0.0371） 1.258±0.2011）50%C/C-Si Cg r o u p 0.643±0.0421） 0.699±0.0371），2） 0.789±0.0381），2） 1.169±0.0761） 1.079±0.0911）100%C/C-Si Cg r o u p 0.641±0.0311） 0.694±0.1191） 0.804±0.1961） 1.026±0.1411） 1.195±0.1741）1）P ＜ 0.01v s p o s i t i v e c o n t r o l g r o u p；2）P ＜ 0.05v s n e g a t i v e c o n t r o l g r o u p.

2.3 溶血試驗結(jié)果

C/C-SiC樣品與純鈦的溶血率均為0.156%，小于5%，C/C-SiC樣品無明顯的溶血反應(yīng)存在。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

100 %C/C-SiC組、純鈦組、陰性對照組均有大量活細(xì)胞集中于左下象限，早期凋亡細(xì)胞量少，陽性對照組右下象限可見明顯增多的早期凋亡細(xì)胞。100%C/C-SiC組4個象限的細(xì)胞比例與純鈦組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），陽性對照組的早期凋亡、正常細(xì)胞含量與其他任一組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3，表3。

表2不同培養(yǎng)時間點(diǎn)各組細(xì)胞RGR與細(xì)胞毒性等級Ta b.2RGRa n d c y t o t o x i c i t y l e v e l a t d i f f e r e n t c u l t u r e t i me p o i n t s 24h 48h 72h 96h 120h RGR（%） Cytotoxicity RGR（%） Cytotoxicity RGR（%） Cytotoxicity RGR（%） Cytotoxicity RGR（%） Cytotoxicity Negative control group 100.00 0 100.00 0 100.00 0 100.00 0 100.00 0Positive control group 67.68 2 33.43 3 24.09 4 21.08 4 9.55 4Titanium group 98.92 1 88.27 1 91.74 1 100.97 0 99.69 125%C/C-SiCgroup 99.10 1 91.94 1 78.57 1 101.64 0 105.44 050%C/C-SiCgroup 90.48 1 78.15 1 81.51 1 94.00 1 87.06 1100%C/C-SiCgroup 90.13 1 77.42 1 83.61 1 80.17 1 98.97 1Group

表3流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果（±s，%）Ta b.3Th e r e s u l t s o f f l o wc y t o me t r y（±s，%）Cells Negative control group Titanium group 100%C/C-SiCgroup Positive control group V-/PI-（LL）89.07±0.161）88.19±1.261）88.16±0.851）81.94±0.79V+/PI-（LR）5.35±0.411）6.05±0.571）5.35±0.151）12.86±0.90V+/PI+（UR） 5.07±0.24 5.29±0.90 5.13±0.89 4.75±0.14V-/PI+（UL） 0.51±0.16 0.47±0.08 0.35±0.12 0.45±0.131）P＜0.05vs positive control group.

3 討論

C/C的碳纖維在特殊角度下編織而成的，具有一定的韌性，符合天然牙在牙槽窩內(nèi)有一定生理動度的特性，Meijer等［5］提出，柔性材料的種植體與骨發(fā)生柔韌的結(jié)合，種植體能更好地把應(yīng)力傳遞到周圍的骨組織，因此它可能是硬性種植體很有前途的替代品。C/C在作為生物材料應(yīng)用方面人們做了較多的研究，細(xì)胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)無細(xì)胞毒性［6，7］，具有很好的細(xì)胞相容性能。在20世紀(jì)90年代初，烏克蘭國家科學(xué)中心哈里科夫技術(shù)物理研究院就展開了C/C作為人工骨組織替換材料方面的大量研究，用該材料生產(chǎn)的人工骨段、關(guān)節(jié)頭都已成功應(yīng)用于臨床，并且取得良好的效果。然而C/C也有不足之處，如材料表面摩擦或長期存在體內(nèi)其碳顆粒會脫落，隨著體液的流動部分沉積于體表形成“黑膚效應(yīng)”。C/C-SiC是在C/C的基礎(chǔ)上利用化學(xué)氣相滲透技術(shù)把SiC基體通過氣相滲透制得，其每束碳纖維表面覆蓋一層熱解碳層然后再由氣相滲透的SiC基體覆蓋，成為了一體材料，因此材料有效阻止了熱解碳層的暴露與碳顆粒的脫落，強(qiáng)度也隨之大大提高。

體外細(xì)胞培養(yǎng)法是研究生物相容性的常用方法之一，體外細(xì)胞毒性試驗是評價生物安全性最早、最重要且又應(yīng)用廣泛的方法。MTT法是檢測材料細(xì)胞毒性的常用方法。本實驗選用L929小鼠成纖維細(xì)胞系作為細(xì)胞毒性的試驗對象，該細(xì)胞系具有易培養(yǎng)與傳代、穩(wěn)定、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在細(xì)胞毒性試驗中被常規(guī)地選用。實驗對材料浸提液的3個稀釋濃度的細(xì)胞毒性進(jìn)行一系列連續(xù)的時間點(diǎn)監(jiān)測，這樣更實際地反映出浸提液濃度及時間的變化對細(xì)胞增殖度的影響。MTT結(jié)果中，只有48h時的50%C/C-SiC組和72h時的25%C/C-SiC組和50%C/CSiC組的OD值與陰性對照組的OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但這3個組與純鈦組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。其他的純鈦組、25%C/C-SiC組、50%C/C-SiC組、100%C/C-SiC組與陰性對照組的OD值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明C/CSiC和純鈦一樣具有良好的細(xì)胞相容性能。陽性對照組與任何一組的OD值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明鉛有明顯細(xì)胞毒性。由于實驗用的C/CSiC來自工業(yè)用材料，不是特殊生產(chǎn)的生物醫(yī)用材料，材料在生產(chǎn)過程中可能會存在某些雜質(zhì)，雜質(zhì)隨浸提液釋出而對細(xì)胞產(chǎn)生影響，這可能是實驗中個別C/C-SiC組與陰性對照組OD值的差異存在統(tǒng)計學(xué)意義的原因之一。

材料植入體內(nèi)后可與血液接觸，若材料存在溶血因素，則會引起血細(xì)胞的破壞。急性溶血試驗作為評價與骨和軟組織長期接觸材料的生物安全性測試方法之一，比較敏感地反映材料對紅細(xì)胞的影響。溶血試驗也被認(rèn)為是細(xì)胞毒性評價的一個補(bǔ)充實驗［8］。按照中國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，急性溶血試驗陰性對照組吸光度值不大于0.03、陽性對照組吸光度值在（0.8±0.3）時，實驗結(jié)果靈敏度較高，本實驗符合這一要求。實驗結(jié)果可見，C/C-SiC與純鈦一樣，其溶血率為0.156%，小于5%，無明顯溶血反應(yīng)存在。

在材料的生物相容性評價中，細(xì)胞凋亡的發(fā)生與材料的性質(zhì)或結(jié)構(gòu)有關(guān)，對凋亡過程的分析有助于了解組織與材料的相互作用［9］。流式細(xì)胞計量術(shù)被廣泛應(yīng)用于分析細(xì)胞活性，它能夠探測細(xì)胞凋亡途徑。由散點(diǎn)圖可發(fā)現(xiàn)，陰性對照組、100%C/C-SiC組、純鈦組大量細(xì)胞集中于左下象限，說明正常細(xì)胞含量多，生長狀況良好，任二者之間未見統(tǒng)計學(xué)差異，由此可見C/C-SiC不促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。而陽性對照組右下象限見明顯增多的早期凋亡細(xì)胞，與其他任一組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明純鉛浸提液促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，具有細(xì)胞毒性。當(dāng)然，本實驗從單一時間點(diǎn)來檢測細(xì)胞的凋亡，這可能并不是代表細(xì)胞凋亡的真實程度，因為細(xì)胞凋亡是一個復(fù)雜并且不同步的過程［9］，所以未來的實驗要把時間因素對細(xì)胞凋亡的影響考慮在內(nèi)。

細(xì)胞毒性試驗是評價材料生物相容性的初級試驗，即一個篩選試驗，確定材料能不能進(jìn)行下一步的研究［10］。目前，C/C-SiC主要應(yīng)用于航天航空和高溫工業(yè)領(lǐng)域，在生產(chǎn)過程中可能存在一些對人體健康有害的物質(zhì)。因此，在進(jìn)行下一步動物體內(nèi)實驗研究之前，需要對有害物質(zhì)的種類和含量進(jìn)行測定，并設(shè)計去除有害的雜質(zhì)，研制符合生物醫(yī)用材料標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)工藝。

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（編輯 陳 姜，英文編輯 劉寶林）

Cytotoxicity of Carbon Fiber-reinforced C-SiCBinary Matrix Composite（C/C-SiC） for Dental Implant Materials

FANGTie-jun1，ZHOUQun1，DILi-sha2，TANZhao-jun1，DENGJing-yi3
（1.Department of Stomatology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Pediatric Dentistry，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China；3.Institute of Metal Research，Chinese Academy of Sciences，Shenyang 110016，China）

ObjectiveTo evaluate the effect of C/C-SiCcomposite on the growth and apoptosis of mouse fibroblast cells.MethodsMouse fibroblasts （L929）were cultured in a series of elution of specimen，MTTassay was performed to investigate the relative growth rates；Hemolytic reaction of specimen to blood cells was detected by acute hemolysis test；Cell scatter diagrams of elutes of negative control group，100%C/C-SiCgroup，titanium group，positive control group was detected by Annexin V-FITC/PIdouble staining，the viable，early apoptotic，late apoptotic and necrosis cells were calculated.ResultsThe cytotoxicity of C/C-SiCcomposite was grade 1，acute hemolysis rate was 0.156%.There were no significant differences between the negative control group and C/C-SiCgroup or between the titanium group and C/CSiCgroup（P>0.05）；The FACSimages showed that the proportions of cells in four quadrants of titanium group，negative control group were not statistically different from C/C-SiCgroup （P>0.05），there were more early apoptotic cells and less viable cells in positive control group than that of other three groups （P<0.05）.ConclusionThe C/C-SiCcomposite was compatible with tested cells，with a relative background of biological safty.

cytotoxicity；hemolysis；MTT；fibroblast L929；composite；apoptosis

R783.1

A

0258-4646（2011）05-0417-05

doi CNKI：21-1227/R.20110523.1813.003

http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20110523.1813.003.html

方鐵鈞（1983-），男，碩士研究生.

周群，E-mail：zhouqun_888@163.com

2010-11-04

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2011-05-1815:25