牙周膜干細胞膜片的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的研究

那思家，黃 芳，郭維華，宮 坤，金 巖，李德超

(1.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，黑龍江佳木斯 154007;

2.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院組織工程中心，陜西西安 710032)

牙周膜干細胞膜片的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的研究

那思家1，黃 芳1，郭維華2，宮 坤2，金 巖2，李德超1

(1.佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，黑龍江佳木斯 154007;

2.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院組織工程中心，陜西西安 710032)

目的:探討牙周膜干細胞膜片的構(gòu)建及其生物學(xué)特性。方法:采用膠原酶消化人牙周膜組織，獲得牙周膜干細胞(Periodontal ligament stem cells，PDLSCs)，經(jīng)體外鑒定、擴增后構(gòu)建PDLSCs細胞膜片，并通過倒置顯微鏡、HE染色、掃描電鏡(SEM)對PDLSCs細胞膜片形態(tài)學(xué)進行檢測。此外，細胞膜片厚度及膜片中細胞密度也被檢測。結(jié)果:PDLSCs成功被分離、培養(yǎng)、鑒定，并且PDLSCs體外培養(yǎng)2周后，獲得白色膜狀PDLSCs細胞膜片。倒置顯微鏡下觀察顯示，細胞復(fù)層生長，細胞呈典型的紡錘狀。體式顯微鏡下觀察顯示，細胞與細胞之間緊密連接。組織學(xué)觀察顯示，細胞與細胞之間存在著大量細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)。掃描電鏡下觀察膜片表面顯示，細胞在膜片上充分伸展，細胞之間緊密連接。PDLSCs細胞膜片厚度由起初的(48±3.2)μm到3周后的(69±3.4)μm，但在第2周細胞厚度(64±3.3)μm，變化最明顯。細胞膜片中的細胞密度檢測顯示連續(xù)培養(yǎng)3周后仍然有大量具有活性的細胞存在，然而細胞密度在第2周時最大。結(jié)論:本研究證明我們已經(jīng)成功探索出一套穩(wěn)定、可靠的PDLSCs細胞膜片構(gòu)建方法，為利用PDLSCs細胞膜片修復(fù)、再生牙周組織及牙周缺損提供了一定的技術(shù)保證。

牙周膜干細胞;細胞膜片;細胞外基質(zhì);組織工程

［牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2011，21(2):77］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2011，21(2):77］

基于工程學(xué)和生命科學(xué)而發(fā)展起來的組織工程學(xué)可以恢復(fù)或提高組織功能。組織工程學(xué)中支架材料主要采用三維立體可降解材料作為一種暫時的細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的代替物使接種在其上的細胞可以產(chǎn)生天然組織結(jié)構(gòu)，而支架材料最終被降解［1］;其中，常規(guī)細胞接種方法涉及細胞培養(yǎng)、細胞擴增、細胞消化及最后將細胞制成單細胞懸液接種于材料上［2］。首先，這種方法將導(dǎo)致一部分細胞在接種過程中損失掉;其次，細胞在支架材料上要重新分泌ECM，而其中一些細胞培養(yǎng)和細胞與細胞黏附過程中產(chǎn)生的蛋白是無法黏附于材料表面的［3－4］。此外，胰酶消化還會改變細胞形態(tài)和生化物質(zhì)，最后導(dǎo)致細胞活性丟失［5］。

目前，一種不含任何可降解支架材料的三維立體細胞膜片被發(fā)明［6－7］，這種膜片可以通過含有維生素C的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)3周而獲得，然后通過細胞刮將其機械刮下［8］。這樣將不會破壞細胞之間的ECM及相關(guān)蛋白，同時可以避免由于胰酶消化而導(dǎo)致的細胞活性的丟失，從而解決了細胞接種于支架材料上的難題［9］。因此，細胞膜片已經(jīng)被應(yīng)用于各個領(lǐng)域中，如組織工程骨組織再生、組織工程肝臟、心肌及角膜修復(fù)等［8－10］。然而，細胞膜片在組織工程牙齒再生領(lǐng)域中應(yīng)用較少［11－12］。

牙周膜干細胞(Periodontal ligament stem cells，PDLSCs)已經(jīng)被證明具有較高的自我更新能力和多向分化能力［13－14］，同時還擁有分泌大量ECM的能力［15－17］。而處于增值期的 PDLSCs細胞膜片同樣也具有多向分化能力，這有益于組織工程的應(yīng)用。雖然一些研究已經(jīng)證明PDLSCs細胞膜片可以修復(fù)牙周缺損［17－18］，但 PDLSCs細胞膜片的制備過程各不相同。本研究旨在探索出一套穩(wěn)定、可靠的PDLSCs細胞膜片構(gòu)建方法，并對PDLSCs細胞膜片的生物學(xué)特性進行鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

α－MEM培養(yǎng)基、2.5g/L胰酶、Ⅰ型膠原酶、谷氨酰胺、青鏈霉素(Gibco公司，美國);胎牛血清(FBS，四季青公司);維生素C、地塞米松、β一甘油磷酸鈉、二甲基亞砜、TritonX－100(Sigma，美國);抗CD 146和 抗 STRO－1抗體(R＆D Systems，美國)。

1.2 方法

1.2.1 牙周膜干細胞(PDLSCs)的分離、培養(yǎng)

選取第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院門診因正畸治療需要拔除的無牙體、牙周組織炎癥和畸形的第二前磨牙10個，分別來自5名身體健康的病人(15～18歲)。牙拔除后立即用0.01 mol/L PBS沖洗，無菌條件下，用銳利刀片刮取根中1/3區(qū)域的牙周膜組織。將組織塊切割成約1 mm×1 mm的小塊，并放置在6孔板中(含150 mL/L FBS、0.292 mg/mL谷氨酰胺、100 U/mL青霉素/鏈霉素的α－MEM培養(yǎng)基)，在37℃、50 mL/L CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2d換液，細胞從組織塊邊緣爬出后，繼續(xù)培養(yǎng)7d，至細胞生長達80%匯合時，用胰酶/EDTA(0.25/0.1，pH=6.4)消化傳代，標記為第一代。

1.2.2 PDLSCs鑒定

1.2.2.1 PDLSCs克隆形成率

將對數(shù)生長期的PDLSCs以胰酶消化，反復(fù)吹打使細胞充分分散制成細胞懸液。將細胞懸液以1×104接種至90 mm培養(yǎng)皿，十字方向輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細胞分散均勻，加5 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)14d后，細胞用40g/L多聚甲醛固定 20 min，棄固定液，晾干。加入結(jié)晶紫染液染色 10～20 min，棄染色液，PBS沖洗干凈。體視顯微鏡下計大于50個細胞的克隆數(shù)，并計算克隆形成率(colony forming unit－fibroblastic，CFU－F)。

1.2.2.2 PDLSCs流式分子鑒定

取培養(yǎng)第5代的 PDLSCs調(diào)整細胞密度為1×106/mL，40g/L多聚甲醛固定15 min;洗滌后分別加入鼠抗人 STRO－1和 CD146單抗，室溫孵育1 h;再次洗滌后分別加入羊抗鼠Ig－FITC，室溫避光45 min;流式細胞儀檢測細胞表面STRO－1和CD146的表達水平。

1.2.2.3 PDLSCs多向分化能力鑒定

將多克隆來源的 PDLSCs細胞懸液，以5×104/mL的密度接種于6孔板中，用含100 mL/L FBS的 α－MEM培養(yǎng) 24 h，待細胞伸展至 60%匯合后，換礦化誘導(dǎo)液(含10 mmol/l β－甘油磷酸鈉、50 μg/mL維生素 C、1 ×10－8mol/L 地塞米松、100 mL/L FBS的α－MEM培養(yǎng)液)連續(xù)培養(yǎng)。鏡下觀察細胞復(fù)層生長并出現(xiàn)圓形結(jié)節(jié)后，繼續(xù)培養(yǎng)至21d，棄原培養(yǎng)液，去離子水反復(fù)漂洗，40g/L多聚甲醛固定30 min，用茜素紅染色。

將多克隆來源的 PDLSCs細胞懸液，以5×104/mL的密度接種于6孔板中，用含100 mL/L FBS的α－MEM培養(yǎng)2～3d，待細胞伸展至90%匯合后，換脂肪細胞誘導(dǎo)液(含 1 μmol/LdEC、0.5 mmol/L IBMX、10 rng/L BPE、100 mmo1/L Indomethacin，100 mL/L FBS的 α－MEM 培養(yǎng)液)誘導(dǎo)3d，用含10 mg/L的牛胰島素、100 mL/L FBS的 α－MEM培養(yǎng)基處理1d，如此循環(huán)2次后，再用含10 mg/L的牛胰島素，100 mL/L FBS的 α－MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7d，每隔 3～4d換液1次。100 mL/L甲醛固定，油紅O染色。

1.2.3 PDLSCs細胞膜片的構(gòu)建

將對數(shù)生長期的第三代PDLSCs以胰酶消化，反復(fù)吹打使細胞充分分散制成細胞懸液。將細胞懸液以1×105接種至90 mm培養(yǎng)皿，十字方向輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細胞分散均勻，加入 10 mL α－MEM培 養(yǎng) 液 (含 100 U/mL維 生 素 C，100 mL/L FBS)。每3d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)3周，于培養(yǎng)2周后，倒置顯微鏡下觀察細胞復(fù)層生長情況。

1.2.4 PDLSCs細胞膜片組織學(xué)檢查及其厚度測量

分別取培養(yǎng)1、2、3周PDLSCs細胞膜片置于40g/L多聚甲醛固定，甲酸－甲酸鈉復(fù)合脫鈣液脫鈣2～3d，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色。分別在1、2、3周細胞膜片的組織學(xué)切片中隨機選5個點，根據(jù)標尺測量其厚度并取平均值，此值即細胞膜片厚度。此部分最少重復(fù)5次。

1.2.5 PDLSCs細胞膜片掃描電鏡檢測

取培養(yǎng)2周牙周膜干細胞膜片與牙本質(zhì)片附合，并置于37℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下孵育3～5d，在0℃條件下25 mL/L戊二醛中固定，經(jīng)脫水和臨界點干燥后，于樣品表面噴鍍薄層金膜，最后在掃描電子顯微鏡下觀察細胞膜片表面情況。

1.2.6 PDLSCs細胞膜片細胞密度檢測

將PDLSCs以2×104/cm2接種在24孔板中，連續(xù)培養(yǎng)1、2、3 周后，毎孔加入100 μL MTT，37 ℃孵育4 h，中止培養(yǎng)，吸去上清培養(yǎng)液。每孔加入500 μLdMSO，振蕩15 min，使結(jié)晶物充分溶解后，毎孔分別吸取100 μL轉(zhuǎn)移到96孔板中，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔490 mm處的光吸收值，求均值。此部分最少重復(fù)5次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PDLSCs的分離、鑒定

PDLSCs細胞形態(tài)呈長梭形類似成纖維樣細胞(圖1A)，一般可穩(wěn)定傳代至少在8代以上，具有很強的克隆形成能力［13－14］(圖1B)和成骨成脂多向分化能力(圖1D，E)，并且 PDLSCs陽性表達Stro－1 和 CD146(圖1C、F)。

2.2 PDLSCs細胞膜片形態(tài)學(xué)觀察

PDLSCs連續(xù)培養(yǎng)2周后，可在培養(yǎng)皿底部出現(xiàn)乳白色膜樣物質(zhì)，此即已經(jīng)形成的PDLSCs細胞膜片。將PDLSCs細胞膜片沿培養(yǎng)皿小心剝離時，可見細胞膜片中細胞與細胞的連接十分緊密，呈膜狀(圖2B)。完全剝離后的細胞膜片，呈現(xiàn)白色皺縮膜狀物并且具有一定厚度和強度(圖2C);倒置顯微鏡下清晰地觀察到細胞復(fù)層生長，呈典型的紡錘狀(圖2A)。HE染色可觀察到PDLSCs細胞膜片中細胞含量較高，細胞外基質(zhì)豐富，細胞與細胞的連接非常緊密(圖2D)。SEM可觀察到PDLSCs在細胞膜片表面伸展良好，細胞與細胞之間存在很好的連接，并形成了一張致密的膜片結(jié)構(gòu)(圖2E)。

2.3 PDLSCs細胞膜片厚度和細胞密度

PDLSCs在含有100 U/mL抗壞血酸的培養(yǎng)基里被連續(xù)培養(yǎng)1、2、3周，并且分別對PDLSCs細胞膜片中細胞密度、細胞膜片的厚度進行檢測。結(jié)果顯示在3周的細胞膜片仍有大量具有活性的細胞存在，但細胞密度在第2周時最大(圖3);并且細胞膜片厚度隨著天數(shù)的增加而增加，在起初的(48±3.2)μm 到3 周后的(69±3.4)μm，然而，在第2周時PDLSCs細胞厚度(64±3.3)μm變化最為明顯(圖4)。

圖1 PDLSCs的分離、鑒定

圖2 PDLSCs細胞膜片的檢測

圖3 PDLSCs細胞膜片活性檢測(各時間段間P＜0.05)

圖4 PDLSCs細胞膜片厚度檢測(各時間段間P＜0.05)

3 討論

由于PDLSCs的高增殖能力和多潛能性以及牙周膜臨床收集比較容易等特點［13－14，16］，使得PDLSCs 被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域［11－12，15－17］。隨著細胞膜片的發(fā)明［18］，PDLSCs細胞膜片也被引入到組織工程學(xué)中。理想的PDLSCs細胞膜片應(yīng)具備以下優(yōu)點:①常規(guī)細胞的獲得是通過胰酶消化而得到的，因此會導(dǎo)致細胞的ECM和細胞與細胞之間的黏附蛋白被破壞，以及細胞表面活性的喪失。而細胞膜片則避免了胰酶的消化，從而保留了大量的ECM和細胞之間的黏附蛋白以及細胞表面活性［3－5，9］;②細胞膜片無需支架材料，避免了常規(guī)細胞被消化、接種于支架材料導(dǎo)致細胞的損失、無法保證材料上的細胞量和支架材料植入體內(nèi)會產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)等［19］。③細胞膜片具有彈性好，可塑性等特點，容易通過注射、包裹等進行移植［8，20］;④最近有研究證實在細胞膜片培養(yǎng)過程中，細胞膜片可以產(chǎn)生血管內(nèi)皮增長因子(VEGF－A)［8］，這有利于細胞膜片在體內(nèi)的血管化，從而有利于組織的再生。但是，目前PDLSCs細胞膜片的制備方法各不相同，其穩(wěn)定、可靠的制備方法尚需進一步研究。

在本實驗中我們分離、培養(yǎng)、鑒定了人的PDLSCs并且成功構(gòu)建PDLSCs細胞膜片該細胞膜片持續(xù)培養(yǎng)3周仍有大量具有活性的細胞存在，但細胞密度在第2周時最大。同時還觀察到細胞在研究期間繼續(xù)產(chǎn)生膠原，其厚度由起初的(48±3.2)μm 到3周后的(69±3.4)μm，但在第2周細胞厚度(64±3.3)μm變化最大。對第2周PDLSCs細胞膜片的形態(tài)通過大體、倒置顯微鏡、HE和SEM進行了觀察，發(fā)現(xiàn)細胞隨機排列，呈長梭形、復(fù)層生長、細胞伸展充分、細胞與細胞之間連接緊密，還可觀察到細胞之間存在著大量ECM。以上數(shù)據(jù)提示連續(xù)培養(yǎng)2周是PDLSCs細胞膜片較為理想的體外培養(yǎng)時間。從而說明我們成功探索出一套穩(wěn)定、可靠的PDLSCs細胞膜片構(gòu)建方法，這為利用PDLSCs細胞膜片修復(fù)、再生牙周組織及牙周缺損提供了一定的技術(shù)保證。

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Construction of periodontal ligament stem cell sheet and characterization of its biological properties

NA Si－jia*，HUANG Fang，GUO Wei－h(huán)ua，GONG Kun，JIN Yan，LIde－chao
(*Department of Oral and Maxillofacial Surgery，College of Stomatology，Jiamusi University，Jiamusi 154004，China)

AIM:To construct periodontal ligament stem cell(PDLSC)sheet and characterize the biological property of the constructed sheet.METHODS:PDLSCs were obtained by collagenasedigestion of human periodontal ligament tissues.After identification，PDLSCs were subcultured to construct PDLSC sheet.Cell sheet was examined by inverted microscope，HE staining and scanning electron microscope.PDLSC sheet thickness and celldensity were assayed.RESULTS:After 2 weeks in vitro culture，a white membranaceous PDLSC sheet formed.Under inverted microscope，it was shown that PDLSCsgrew in multilayer and retained their fibroblastic spindle shape.Histological examination indicated abundant extracellular matrix(ECM)existed among the cells.By scanning electron microscopy，it was found that PDLSCs expanded adequately on the surface of PDLSC sheet and PDLSCs connected closely.Cell sheet thickness varied from an initial 48 ±3.2 μm to 69 ±3.4μm at 3 weeks.The cells in the cell sheet were shown to be viableduring the 3－week culture period，with the maximum cell number in the second week.CONCLUSION:We successfully established a stable and reliable method for constructing PDLSC sheet，which provided technological founda-tion for future studies in regeneration and repair of periodontal tissuedestruction.

periodontal ligament stem cells;cell sheet;extracellular matrix;tissue engineering

R780.2

A

1005－2593(2011)02－0077－06

2010－11－16;

2010－12－29

那思家(1984－)，男，滿族，黑龍江綏化人。碩士生(導(dǎo)師:李德超)

李德超，E －mail:dechaoli2004@yahoo.com.cn

金 巖，E －mail:yanjin@fmmu.edu.cn

·臨床經(jīng)驗總結(jié)·