影響無菌苗體系建立因素的研究進(jìn)展

陳麗閩，毛碧增

(浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310029)

影響無菌苗體系建立因素的研究進(jìn)展

陳麗閩，毛碧增

(浙江大學(xué) 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310029)

綜述無菌苗體系建立過程中外植體選擇、外植體消毒、內(nèi)生菌污染控制等關(guān)鍵因素的研究進(jìn)展，并對存在問題進(jìn)行探討。

外植體;消毒劑;內(nèi)生菌

1902年德國植物學(xué)家 Haberlandt首次提出的植物細(xì)胞全能性理論是植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)［1］，直到20世紀(jì)60年代，Haberlandt的預(yù)言才逐步實(shí)現(xiàn)，被譽(yù)為“植物組織培養(yǎng)之父”。植物組織培養(yǎng)經(jīng)歷了理論創(chuàng)建與實(shí)踐初探、技術(shù)發(fā)展與深化、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等階段，從20世紀(jì)60年代至今，各種植物快繁技術(shù)得以廣泛應(yīng)用，使植物組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)入“工廠化”時(shí)代，全球涌現(xiàn)一大批種子種苗公司，如荷蘭的 VDE Flowerbulbs，智利南方球莖公司，美國維生種苗公司等。美國Wyford國際公司，印度American Hybird Seeds種子公司等每年的產(chǎn)量達(dá)到數(shù)千萬株，組培成功的植物種類多達(dá)1 500種，產(chǎn)業(yè)化、商品化生產(chǎn)的有幾百種。植物次生代謝物的開發(fā)，以及20世紀(jì)90年代轉(zhuǎn)基因技術(shù)的蓬勃發(fā)展，賦予了組織培養(yǎng)新的發(fā)展前景。

無菌苗的建立是植物組織培養(yǎng)的首要關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是整個(gè)組織培養(yǎng)的起始點(diǎn)，外植體污染以及褐化是該環(huán)節(jié)的主要問題，決定著整個(gè)實(shí)驗(yàn)的成敗。為此，我們對影響無菌苗體系建立的幾個(gè)關(guān)鍵因素研究作一概述。

1 外植體的種類

外植體 (explant)指植物組織培養(yǎng)中作為離體培養(yǎng)的材料。

植物細(xì)胞全能性是指植物體的每一個(gè)細(xì)胞都含有能發(fā)育成完整個(gè)體的全套基因，這些基因在適宜的外界條件下將按照某種特定的程序先后表達(dá)，最終分化形成一個(gè)完整植株［2］，植物的器官，組織、胚胎、細(xì)胞以及原生質(zhì)體等都是常用的外植體。

幼胚是最早作為外植體的材料，早在1904年Hanning通過培養(yǎng)蘿卜和辣根未成熟的幼胚獲得了小苗;1926年Harlan大麥幼胚培養(yǎng)成功。隨著組織培養(yǎng)研究的深入以及被研究物種的增多，外植體的種類逐漸豐富，主要分為5大類，即胚胎培養(yǎng)(成熟或未成熟胚)、器官培養(yǎng) (根、莖、葉、花、果)、組織培養(yǎng) (頂端分生組織、側(cè)生分生組織和居間分生組織)、細(xì)胞培養(yǎng) (單個(gè)的游離細(xì)胞)、原生質(zhì)體培養(yǎng)。

組織培養(yǎng)已成功的常見植物:胚胎培養(yǎng)有水稻、小麥、大麥、玉米、豌豆、高粱、棉、紅麻、劍麻、煙草、甜菜、向日葵、棕櫚、萵苣、蔥、蘋果、梨、核果、龍眼、山楂、甜瓜、獼猴桃、松樹、百合、蘭花［3］;器官培養(yǎng)中根培養(yǎng)有胡蘿卜、掌葉大黃［4］、長春花［5］、高山紅景天［6］、光果甘草［7］、褐脈少花龍葵［8］、煙草［9］，莖培養(yǎng)有馬鈴薯、甘薯、木薯、煙草、甘蔗、橡膠樹、油菜、棕櫚、石刁柏、蘋果、梨、核果、山楂、葡萄、草莓、獼猴桃、香蕉、番木瓜、針葉松、海岸紅杉、楊樹、桉樹、泡桐、百合、水仙、菊花、杜鵑、蘭花［3］，葉培養(yǎng)有豌豆、甘薯、高粱、煙草、番茄、茄子、芹菜、百合、蘭花［3］，花培養(yǎng)有水稻、小麥、大麥、玉米、馬鈴薯、苧麻、紅麻、亞麻、煙草、茶樹、橡膠樹、花生、大豆、蕓苔、葡萄、番茄、茄子、石刁柏、柑橘、蘋果、荔枝、龍眼、草莓、甜瓜、西瓜、楊樹、菊花［3］，芽培養(yǎng)有苧麻、西瓜［3］; 分生組織培養(yǎng)有蔥、甘薯［10］、駿棗［11］、球根花卉 (唐菖蒲、水仙、郁金香等)［3］;原生質(zhì)體培養(yǎng)有馬鈴薯、棉、油菜、大豆、蕓苔、番茄、茄子、萵苣、胡蘿卜、柑橘、小麥、大麥［3］。

不同品種、生長年齡和生理狀態(tài)以及同一植株的不同部位、器官和組織，植物細(xì)胞的分化再生能力具有差異。1934年White以番茄根尖為材料成功獲得第1個(gè)可以正常生長的無性系，從而使非胚器官培養(yǎng)首次獲得成功。隨著研究深入，研究者們發(fā)現(xiàn)番茄的葉片更適宜作為組織培養(yǎng)的材料，如目前番茄的轉(zhuǎn)基因研究常采用葉盤法［12］。

此外外植體的選擇既可以考慮實(shí)驗(yàn)的可行性，也可以結(jié)合研究目的，如脫病毒。眾所周知，病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的。在受侵染的植株中，頂端分生組織一般說或者是無病毒的，或者是只攜帶有濃度很低的病毒［13］，故可選用莖尖分生組織作為外植體。不少文獻(xiàn)已有相關(guān)報(bào)道，1952年，法國人Morel將帶病毒的大麗花進(jìn)行莖尖離體培養(yǎng)，獲得去病毒植株;1960年，Morel采用相同方法獲得了蘭屬 (Cymbidium)植物的再生植株。這一技術(shù)很快被歐美東亞許多國家的花卉生產(chǎn)企業(yè)所應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了蘭花工業(yè)化生產(chǎn)，形成了特有的“蘭花工業(yè)”。1964年印度德里大學(xué)的 Guha和Maheshwari在培養(yǎng)南洋金花未成熟花藥時(shí)發(fā)現(xiàn)了由大量胚狀體形成的小植株;1967年Bourgin等從煙草花藥培養(yǎng)中獲得單倍體植株，證實(shí)花藥發(fā)育成單倍體植株的可能，此后花藥培養(yǎng)成為獲得單倍體的一條最佳途徑，成功應(yīng)用于水稻、小麥等作物育種，并在改變植物遺傳性的應(yīng)用研究和基礎(chǔ)研究中有著廣泛的應(yīng)用前景［3］。

2 消毒方法以及消毒劑種類

2.1 消毒劑種類以及工作原理

對外植體表面的病原菌進(jìn)行有效的消毒是無菌苗體系建立的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，消毒劑種類的選擇應(yīng)因外植體的種類而異，目前采用的比較多消毒劑為酒精、升汞、次氯酸鈉、溴水、過氧化氫等 (表1)。

表1 消毒劑的種類及其工作原理

2.2 消毒方法

外植體的消毒方法可以是消毒劑單獨(dú)使用，也可以是各種消毒劑的組合使用，但是引起組織培養(yǎng)污染的細(xì)菌、真菌等各種微生物，不僅存在于植物體表，甚至存在植物體內(nèi)，常規(guī)的消毒一般只對植物的表面進(jìn)行消毒，二步消毒法或內(nèi)生菌的消毒可徹底消除組培中出現(xiàn)的各種污染現(xiàn)象。

2.2.1 表面消毒

植物體表、體內(nèi)均會(huì)存在各種微生物，因此，選擇一種有效的消毒方式是組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。

種子選用濃硫酸浸泡［14］，70% ～75%酒精 +0.1%升汞［15］，0%酒精 +10% 雙氧水［16］，70% 酒精 +10%次氯酸鈉［17］，70%酒精 +40%次氯酸鈉［18］; 莖尖選用 70% 酒精 +10% 次氯酸鈉［19－20］，75%酒精 +0.1% 升汞［21－22］，70% 酒精 +0.1% 升汞［23－24］，70% 酒 精 +20% 次 氯 酸 鈉 +0.1% 升汞［25］; 根尖適用 70% 酒精 +0.1% 升汞［26］，或種子滅菌待長出無菌根后進(jìn)行組織培養(yǎng)［27－28］;花藥選用70% ～75%酒精+0.1%升汞［29］，70%酒精+15%次氯酸鈉［30］;葉片選用 70% ～75%酒精 +0.1% 升汞［31－33］，0.1% 升汞［34］。

70%～75%酒精與0.1%升汞的組合最常用，但要依不同的外植體適當(dāng)調(diào)整消毒時(shí)間和消毒劑的濃度;次氯酸鈉也較常用，但因其具有漂白作用，不用于葉片的消毒。對葉片的消毒可以使用10%的巴氏消毒液;此外，對于帶有絨毛的外植體，為使滅菌劑濕潤整個(gè)組織，還需在消毒液中加入幾滴表面活性劑吐溫20或吐溫80。在消毒前，流水沖洗外植體數(shù)分鐘。消毒后要用無菌水將外植體沖洗干凈，以防殘液對植物細(xì)胞的傷害。

酒精消毒時(shí)要選擇適宜濃度。因高濃度酒精，會(huì)使細(xì)菌蛋白迅速脫水，造成細(xì)菌表面蛋白質(zhì)首先變性凝固，形成了一層堅(jiān)固的包膜，酒精反而不能很好地滲入細(xì)菌內(nèi)部，以致影響其殺菌能力;酒精濃度若低于75%，會(huì)因滲透性降低而影響殺菌能力。各組培工作者的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，酒精的工作濃度范圍為70%～75%，綜合考慮細(xì)菌自身的滲透勢，為此我們建議最佳工作濃度為75%。

使用氯化汞消毒，要充分把握好消毒濃度和消毒時(shí)間。因?yàn)槲⒘康闹亟饘匐x子能在細(xì)胞內(nèi)不斷累積并最終對生物發(fā)生毒害作用，或引起生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)的改變。

2.2.2 內(nèi)生菌消毒

控制內(nèi)生菌污染是影響組培技術(shù)成功的又一關(guān)鍵因素。關(guān)于植物內(nèi)生菌(endophyte)的概念范疇有著廣泛的爭議，1991年 Petrini在 Carroll和Clay提出的概念基礎(chǔ)上，將內(nèi)生菌定義為:內(nèi)生菌包括那些在其生活史中的某一段時(shí)期生活在植物組織內(nèi)，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的菌，該定義還包括了那些在其生活史中的某一階段營表面生的腐生菌，對宿主暫時(shí)沒有傷害的潛伏性病原菌和菌根菌［35］。內(nèi)生菌可通過組織學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接產(chǎn)生擴(kuò)增出微生物DNA的方法來證明其內(nèi)生，被感染的寄主 (至少是暫時(shí))不表現(xiàn)出來外在病癥［36］。

國內(nèi)在內(nèi)生菌的開發(fā)應(yīng)用中研究得較深入，如在制藥、植物保護(hù)、污染物降解方面，進(jìn)行了菌種的分離鑒定與篩選［37］。而國外學(xué)者在內(nèi)生菌污染方面的研究重點(diǎn)在于闡明引起其污染的原因及控制策略 (表2)。

表2 引起組織培養(yǎng)污染的內(nèi)生菌及控制

由表2可知，通過抗生素、生物活性物質(zhì)、對組培苗生長環(huán)境的控制等措施可以有效控制內(nèi)生菌引起的污染問題。

3 小結(jié)

無菌苗體系的建立需要綜合考慮各種因素作用。依細(xì)胞的全能性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募熬唧w的植物種類，選擇合適的外植體;同時(shí)，選取的外植體、各種消毒劑自身的性質(zhì)共同決定了采用何種消毒劑及方法;關(guān)于內(nèi)生菌，黃小榮等［51］則認(rèn)為:植物組培中細(xì)菌污染的原因是休眠細(xì)菌芽孢萌發(fā)的結(jié)果。

在內(nèi)生菌消毒中，由于植物體中的內(nèi)生細(xì)菌潛伏得較深，表面消毒無法將其消除。這種污染在外植體的初期培養(yǎng)中 (前幾代的繼代培養(yǎng))，不易被肉眼察覺，隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，菌量逐漸累積，才在培養(yǎng)基上顯現(xiàn)出來［52］。植物體內(nèi)某些內(nèi)生菌是與植物互利共生的，休眠的內(nèi)生菌也會(huì)因培養(yǎng)基條件的改變而被激活［42，53］。綜上所述，要建立一個(gè)無菌苗體系，要充分考慮外植體、消毒劑、培養(yǎng)基等各種因素，而不能將各種因素孤立起來。

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S 339.4

A

0528-9017(2011)03-0483-05

文獻(xiàn)著錄格式:陳麗閩，毛碧增.影響無菌苗體系建立因素的研究進(jìn)展 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(3):483－487.

2010-12-09

浙江省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目 (2005C13016)

陳麗閩 (1986－)，女，浙江金華人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锝M織培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)基因分子育種。E-mail:liminchen@zju.edu.cn。

注:毛碧增系通信作者，E-mail:maobz@zju.edu.cn。

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