益氣活血法對腦出血大鼠腦組織Ⅳ型膠原表達(dá)的影響

羅 娟 唐 濤 吳 季 周華軍 吳 婧 (中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，湖南 長沙 410008)

益氣活血法對腦出血大鼠腦組織Ⅳ型膠原表達(dá)的影響

羅 娟 唐 濤 吳 季 周華軍 吳 婧 (中南大學(xué)湘雅醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，湖南 長沙 410008)

目的 探討益氣活血中藥對腦出血大鼠腦損傷區(qū)組織Ⅳ型膠原表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。方法 150只SD大鼠被隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、益氣活血組、益氣組和活血組各30只。用Ⅶ型膠原酶誘導(dǎo)腦出血大鼠模型。各組相應(yīng)灌服蒸餾水、益氣活血法代表方補陽還五湯全方及其益氣組分、活血組分藥物。用免疫組化方法檢測術(shù)后3、7、14、21 d和28 dⅣ型膠原的表達(dá)，其結(jié)果進(jìn)行平均光密度掃描半定量分析。結(jié)果假手術(shù)組不同時間點Ⅳ型膠原表達(dá)未見明顯陽性信號;模型組、益氣組、活血組及益氣活血組腦出血后3 d即有Ⅳ型膠原表達(dá)，模型組及益氣組至21 d達(dá)到高峰，隨后開始下降;活血組及益氣活血組表達(dá)高峰時間提前至14 d，并至21 d時仍維持一定的表達(dá)水平;各個時間點益氣活血組表達(dá)均高于其他組。結(jié)論 益氣活血中藥可能通過增強(qiáng)腦出血后血腫周圍腦組織Ⅳ型膠原的表達(dá)參與組織修復(fù)。

腦出血;血管新生;Ⅳ型膠原;免疫組化;益氣活血法

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)發(fā)病率雖占所有類型腦血管病的30%，但其以50%以上的病死率高居首位，40%的存活者留有嚴(yán)重殘疾，是臨床的危急重癥〔1〕。而腦出血患者中老年人所占比重很大。研究證實，腦出血血腫區(qū)及其周邊區(qū)局部腦血流量下降，是導(dǎo)致臨床癥狀惡化、影響腦水腫吸收消散的重要原因〔2〕，因此治療腦出血應(yīng)早期改善腦部供血，以防止出現(xiàn)缺血性腦損傷。而通過血管新生促進(jìn)血腫區(qū)及其周邊區(qū)微血管網(wǎng)重建，改善損傷區(qū)微循環(huán)，可能防治繼發(fā)性缺血損傷，并減輕生物活性物質(zhì)對腦組織的損害，還可能為損傷神經(jīng)元的修復(fù)、突觸重建和神經(jīng)發(fā)生創(chuàng)造良好的微環(huán)境，進(jìn)而為神經(jīng)功能的恢復(fù)奠定基礎(chǔ)〔3〕。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)主要是由膠原(collagens)、連接糖蛋白等不溶結(jié)構(gòu)成分混合而成的組織特異性三維結(jié)構(gòu)〔4〕;其組成是動態(tài)變化的，腦出血后血液流出和血腦屏障破壞，改變血管周邊的ECM組成、血管-ECM間的結(jié)構(gòu)關(guān)系〔5，6〕。本實驗用益氣活血治法經(jīng)典方劑補陽還五湯及其益氣、活血組分分別進(jìn)行干預(yù)，觀察益氣活血方藥對出血后腦組織中細(xì)胞外基質(zhì)成分Ⅳ型膠原表達(dá)的影響，初步探討其在腦出血微血管系統(tǒng)重建過程中的作用機(jī)制，為益氣活血治法在腦出血中的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康清潔級SD大鼠150只〔許可號:SCXK(湘)2006-0002〕，雄性，體質(zhì)量(220 ±20)g，鼠齡8～12 w，動物及飼料均購自中南大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 藥物與主要試劑 補陽還五湯全方(黃芪∶赤芍∶當(dāng)歸∶川芎∶桃仁∶紅花∶地龍用量按照20∶3∶3∶2∶3∶3∶3比例)、補陽還五湯益氣組分(黃芪)與補陽還五湯活血組分(赤芍、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、地龍)采用粉末制劑，與蒸餾水配成溶液后濃度為全方 0.44 g/ml，益氣 0.225 g/ml，活血 0.215 g/ml。Stoelting TL-2鼠腦立體定位儀(美國);Leica1850恒冷冰凍切片機(jī)(德國);Ⅶ型膠原酶(Sigma公司);Ⅳ型膠原多克隆抗體(Santa Cruz公司);辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(二抗)，親合素-生物素酶復(fù)合物(ABC)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 腦出血動物模型制備〔7〕腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，俯臥位固定于鼠腦立體定位儀上，按無菌操作原則，于前囟后1.4 mm、旁開3.2 mm、深5.6 mm處(位于近內(nèi)囊的蒼白球內(nèi))微量進(jìn)樣器緩慢注入0.5 U的Ⅶ型膠原酶滅菌生理鹽水2.5μl。假手術(shù)組以同樣方法在此點注入滅菌生理鹽水2.5μl。造模成功后均表現(xiàn)為行動遲緩，拖步行走，旋轉(zhuǎn)爬行，容易激惹，半側(cè)偏癱，前爪抓力下降等。

1.2.2 動物分組及處理 150只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成5組:假手術(shù)組、模型組、益氣組、活血組、益氣活血組，各組30只。其中假手術(shù)組與模型組均給予蒸餾水灌胃，每次2 ml，每日2次;益氣組、活血組和益氣活血組分別用各自方藥2 ml，各組于術(shù)后3、7、14、21 d和28 d各隨機(jī)抽取6只大鼠，用10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，經(jīng)升主動脈灌注4℃的多聚甲醛10 m l/min，取腦。各組每個時間點取6只大鼠的標(biāo)本，在相同的固定液中固定4 h，依次放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、30%蔗糖溶液沉底，放入Leica1850恒冷切片機(jī)行連續(xù)冠狀切片，片厚30μm，抗凍存緩沖液保存置入－20℃冰箱備用。

1.2.3 免疫組化ABC法檢測Ⅳ型膠原陽性表達(dá)及圖像分析冰凍切片于室溫中復(fù)溫，用3%的過氧化氫-甲醇室溫下浸泡10 min;5%的牛血清白蛋白37℃封閉60 min;滴加Ⅳ型膠原多克隆抗體(1∶500)，37℃孵育60 min，4℃過夜;滴加二抗兔抗山羊 IgG(1∶200)和 ABC 復(fù)合物(1∶100)，37℃ 各孵育 60 min;DAB鏡下控制顯色，脫水，透明中性樹脂封片。除滴封閉液時不洗外，各步驟間用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min×3次。用PBS代替一抗作實驗對照。免疫組化陽性表達(dá)染色為棕褐色。用Motic Images Advance 3.2圖像分析軟件計數(shù)，在光鏡下(400倍)每只大鼠隨機(jī)選擇3張片，每張片選擇3個互相不重疊的視野，共9個視野進(jìn)行分析，測定其陽性面積(mm2)和平均光密度(OD)值，以二者乘積代表Ⅳ型膠原表達(dá)水平，取平均數(shù)作為一只大鼠計數(shù)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料以±s表示，組間比較用單因素方差分析，方差齊時，采用LSD檢驗;方差不齊時，采用Dunnett's T3檢驗。

2 結(jié)果

假手術(shù)組不同時間點Ⅳ型膠原未見明顯陽性表達(dá);其余各組3～28 dⅣ型膠原表達(dá)水平升高;模型組、益氣組、活血組及益氣活血組在腦出血后3 d即有Ⅳ型膠原表達(dá)，并逐漸增強(qiáng)，血腫周圍有少量不規(guī)則血管段出現(xiàn)，且以益氣活血組最明顯;模型組及益氣組在21 d表達(dá)達(dá)到高峰，隨后開始下降，益氣組各時間點均較模型組增強(qiáng)(P＜0.01);活血組各時間點表達(dá)增強(qiáng)，14 d時達(dá)到高峰，并高于同時間點模型組和益氣組(P＜0.01);益氣活血組Ⅳ型膠原表達(dá)水平于14 d達(dá)到高峰，其他時間點的表達(dá)也高于其他組(P＜0.01，P＜0.05)，血腫區(qū)可見明顯血管段成條索狀，對應(yīng)出現(xiàn)管腔擴(kuò)大，血腫區(qū)血管陽性段的表達(dá)最明顯。見圖1，圖2。

圖1 假手術(shù)組及益氣活血組各時間點血腫區(qū)血管新生情況

圖2 益氣活血法對腦出血大鼠Ⅳ型膠原表達(dá)的影響

3 討論

腦出血作為老年人多發(fā)疾病，能否在有效時間窗內(nèi)救治并獲得良好預(yù)后，對于提高患者的生活質(zhì)量有著重要的關(guān)系。腦出血屬祖國醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，氣虛血瘀是該病的基本病機(jī)，“元氣既虛，必不能達(dá)于血管，血管無氣，必停留血瘀”，故中醫(yī)多以益氣活血法治療腦出血，其代表方劑為清代名醫(yī)王清任創(chuàng)立的補陽還五湯。方中重用黃芪以大補元氣，取氣旺血行之義，為君藥;當(dāng)歸尾是當(dāng)歸的尾梢部分，破血之力甚強(qiáng)，活血祛瘀而不傷血，為臣藥;赤芍、川芎活血行氣，桃仁、紅花活血通經(jīng)祛瘀，為行血活血之要藥，四藥合用，協(xié)同當(dāng)歸尾活血祛瘀，同為佐藥;地龍其性走竄，通經(jīng)活絡(luò)，配合以上諸藥以行藥勢，為使藥。全方合用，使氣旺血行，祛瘀通絡(luò)，以通為補，以補為通，通補兼施，共奏益氣活血之功效。

腦出血后微血管系統(tǒng)重建對于腦組織修復(fù)、神經(jīng)元抗損傷、神經(jīng)功能恢復(fù)是極其重要的〔8〕，在此過程中，ECM與血管新生相互作用，即血管新生可以導(dǎo)致ECM成分的降解、重塑，而ECM對新生血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、存活和新生血管成型、成熟有重要作用〔5〕。

Ⅳ型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，是一種網(wǎng)狀膠原，主要存在于毛細(xì)血管和大血管腔的基底膜中，也參與到血管新生中〔9〕。本實驗中，3 d時即出現(xiàn)了Ⅳ型膠原的表達(dá);7 d時，益氣活血組Ⅳ型膠原的表達(dá)開始高于其他三組;到14 d時，Ⅳ型膠原的表達(dá)達(dá)到高峰，較模型組、益氣組和活血組的表達(dá)提前，提示益氣活血法對腦出血后Ⅳ型膠原表達(dá)的促進(jìn)作用更早;21 d時，益氣活血組Ⅳ型膠原的表達(dá)仍要高于其他三組，此時陽性血管管腔較前期明顯增寬并出現(xiàn)分支，提示21 d后益氣活血組腦出血大鼠所表現(xiàn)的血管腔化作用明顯增強(qiáng)，進(jìn)入血管生成的塑型階段;28 d時，益氣活血組與活血組Ⅳ型膠原仍維持較高水平的表達(dá)，并高于模型組及益氣組同期水平，說明益氣活血法與活血法均能延緩Ⅳ型膠原的下降，維持微血管新生過程，促進(jìn)大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)。

目前對Ⅳ型膠原的調(diào)節(jié)機(jī)制研究較多、也得到公認(rèn)的是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmatalloproteinases MMP)，尤其是MMP-2、MMP-9。聶亞雄等研究證明腦缺血后MMP-2和MMP-9表達(dá)上升，但腦溢安可下調(diào)其表達(dá)〔10〕，韓梅等進(jìn)行的研究顯示益氣活血化瘀治療能下調(diào)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和血管內(nèi)皮剝脫誘導(dǎo)的MMP-2表達(dá)，減輕膠原降解，進(jìn)一步說明益氣活血化瘀中藥能同時在多環(huán)節(jié)、多位點上抑制血管內(nèi)皮損傷引起的 ECM 重塑〔11〕。

已有研究證實，在腦出血過程中，應(yīng)用益氣活血中藥可上調(diào)血小板反應(yīng)蛋白(TSP)-1及TSP-2的表達(dá)，而TSP-1及TSP-2可抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)〔12〕，作為主要降解Ⅳ型膠原的酶MMP-2、MMP-9的減少可促進(jìn)Ⅳ型膠原合成增加，進(jìn)而更促進(jìn)了血管新生的增加及血管穩(wěn)定。

綜上所述，本研究顯示益氣活血法和活血法均能對Ⅳ型膠原有不同時相的上調(diào)作用，且益氣活血法的療效優(yōu)于活血法和益氣法，活血法療效優(yōu)于益氣法，提示益氣法與活血法合用的補陽還五湯由于其二者的協(xié)同作用，增強(qiáng)了其促進(jìn)Ⅳ型膠原的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移，加速微血管的新生，有利于恢復(fù)病灶區(qū)的血液灌注。

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Effect ofmethod of supplementing Qiand activating blood circulation on the expression of typeⅣcollagen in brains of intracerebral hemorrhage rats

LUO Juan，TANG Tao，WU Ji，et al.
Xiangya Hospital Central-South University，Changsha 410008，Hunan，China

Objective To investigate themechanisms ofmethod of supplementing Qiand activating blood circulation on the expression of typeⅣ collagen in brains of intracerebral hemorrhage(ICH)rats.M ethods ICH modelwas induced by injecting collagenase typeⅦstereotaxically into rightglobus pallidus.One hundred and fifty SD ratswere randomly divided into shame operation，ICH model，supplementing Qi，activating blood circulation，supplementing Qi and activating blood circulation groups ，each group had 30 cases.The last 3 treated groups were administered orally with the classicmethods of supplementing Qiand activating blood circulation prescription of Buyang Huanwu decoction.The expressions of type Ⅳ collagen were assayed by immunohistochemistry on 3，7，14，21 and 28 days after the onset，then the average optical density of the positivemicrovessels were counted.Results No hematoma and obvious local pathological changes were appeared in brain tissues of sham operation group at different time points during the experiment.Microvascular angiogenesis of supplementing Qi and activating blood circulation group wasmore than thatof supplementing Qi，activating blood circulation andmodelgroups.Immunohistochemical researches showed thatatdifferent time points，the expression of typeⅣ collagen had no significant changes in sham operation group.The expressions of type Ⅳ collagen in model and threemedically treated groupswere observed on 3 day，the expressionswere increased gradually，peaked on 21 day in supplementing Qiand model groups，and then started to decrease.The peak time of activating blood group and supplementing Qi and activating blood circulation group were advanced on 14 day，and the expressions sustained high levels to 28 day.Conclusions Themethod of supplementing Qiand activating blood circulation can up-regulate the expressions of typeⅣcollagen after ICH to participate in the tissue repair.

Intracerebral hemorrhage;Angiogenesis;TypeⅣ collagen;Immunohistochemistry;Method of supplementing Qiand activating blood circulation

R743.3

A

1005-9202(2011)15-2882-03

國家自然科學(xué)青年基金(No.30400581，30873221)

唐 濤(1972-)，男，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管疾病中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)與臨床研究。

羅 娟(1985-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事腦血管疾病中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)與臨床研究。

〔2010-09-28收稿 2010-12-20修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)