聚乙二醇修飾多壁碳納米管對(duì)質(zhì)粒DNA的影響

勞文艷， 商迎輝， 焦 正， 勞鳳學(xué)

(1.北京聯(lián)合大學(xué)北苑校區(qū)，北京100012;2.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，上海200444)

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)的用途越來(lái)越廣［1-6］，與科研人員和普通大眾的接觸也越來(lái)越多.因此，在CNTs基材料廣泛應(yīng)用之前，深入徹底地研究其健康與安全問(wèn)題非常有必要.CNTs或含CNTs復(fù)合材料的生物相容性研究已經(jīng)成為CNTs研究領(lǐng)域的一個(gè)新熱點(diǎn).Webster等［7］研究了一系列復(fù)合材料 polyurethane (PU)/CNTs和星狀細(xì)胞的關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)隨著CNTs含量的提高，材料中的星狀細(xì)胞量減少，并且阻礙了星狀細(xì)胞的增殖.Hu等［8］和Gabay等［9］的研究結(jié)果顯示，經(jīng)聚乙烯亞胺化學(xué)修飾后的CNTs對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用.Supronowicz等［10］發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)電復(fù)合材料polylactic acid(PLA)/MWNTs通過(guò)交流電擊能夠明顯提高造骨細(xì)胞的增殖速度.

DNA是生物體中一類最基本的大分子，是遺傳信息的原初載體，是細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和遺傳的重要物質(zhì)基礎(chǔ).研究由納米材料所導(dǎo)致的DNA結(jié)構(gòu)和功能的變化，有利于從微觀角度理解納米材料的生物相容性本質(zhì)，從而為探討和解決宏觀領(lǐng)域中的實(shí)際問(wèn)題提供依據(jù).本研究通過(guò)電泳實(shí)驗(yàn)和原子力顯微鏡觀測(cè)，分析多壁碳納米管(MWNTs)和PEG修飾MWNTs與質(zhì)粒DNA的作用情況，并從二者對(duì)質(zhì)粒DNA損傷的角度考察了MWNTs的生物相容性.

1 實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)中使用的MWNTs直徑為10～30 nm，長(zhǎng)度為5～50 μm，購(gòu)自深圳市納米港公司.本實(shí)驗(yàn)采用混酸氧化法純化MWNTs，用V(濃硝酸)∶V(濃硫酸)=1∶3的混合酸超聲處理MWNTs，通過(guò)離心分離和真空干燥，得到的黑色固體為純化MWNTs.PEG修飾MWNTs的合成方法為如下：取干燥的50 mg純化MWNTs，加入15 mL pH=7.0的磷酸鹽緩沖液中，超聲分散均勻，加入 200 mg的碳二亞胺與250 mg N-羥基琥珀酰亞胺，超聲30 min，再加入500 mg PEG-1500，置于磁力攪拌器上室溫?cái)嚢?4 h，反應(yīng)后的溶液用水洗滌，12 000 r/min離心分離30 min，得到的固體用去離子水洗滌后再用0.22 μm的纖維素微孔濾膜真空過(guò)濾，得到PEG修飾MWNTs.原始MWNTs、純化MWNTs和PEG修飾MWNTs的透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)照片如圖1所示.

本實(shí)驗(yàn)中所使用的其他試劑均為分析純.實(shí)驗(yàn)采用堿法抽提質(zhì)粒DNA，所用質(zhì)粒為pGBKT7，大小約為7.3 kb.MWNTs經(jīng)超聲振蕩后與DNA混合形成混合溶液，然后進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn).取9 μL樣品加入1 μL的loading buffer(染色劑)混合均勻，按照由高到低的濃度順序，用移液槍依次在每個(gè)孔中注入樣品、質(zhì)粒和loading buffer的混合物，最后加入水、質(zhì)粒和loading buffer的混合物作為對(duì)照.電泳實(shí)驗(yàn)電壓設(shè)定為120 V，時(shí)間設(shè)定為50 min.

使用天能凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行凝膠成像，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)的分析軟件對(duì)凝膠中不同形態(tài)DNA的光密度進(jìn)行定量分析，從而得到不同質(zhì)量濃度下MWNTs對(duì)質(zhì)粒DNA的損傷情況.

使用島津公司的SPM-9600AFM觀察MWNTs對(duì)DNA的作用.對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行成像時(shí)，AFM采用如下的制樣方法.在室溫下，將250 μg/mL的原始WMNTs、純化WMNTs和PEG修飾MWNTs與DNA溶液混合(質(zhì)粒DNA終質(zhì)量濃度控制在250 ng/mL左右)，渦旋震蕩器上恒溫(25℃)輕輕震蕩24 h.用移液槍吸取5 mL的MWNTs與質(zhì)粒DNA的混合液，緩緩滴于3-氨基丙基三乙氧基硅烷-云母襯底上，隨后用干凈平整的封口膜輕輕覆蓋在液滴上，并使溶液均勻地平鋪在襯底上.將襯底靜置幾分鐘后揭去封口膜，吸取少量的去離子重蒸水沖洗襯底面，重復(fù)沖洗若干次以便去除未吸附的質(zhì)粒.最后，將沖洗后的襯底置于陰涼干燥處，使殘留在襯底上的水分自然風(fēng)干，樣品制備完畢.由于是測(cè)試生物樣品，掃描速率要盡量放慢在0.5 Hz左右，振源幅度要盡量調(diào)低，設(shè)置點(diǎn)調(diào)高，確保在成像時(shí)，AFM的針尖以較小的力拍擊樣品表面，從而不會(huì)對(duì)樣品產(chǎn)生破壞.

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

圖1 MWNTs的TEM圖Fig.1 TEM images of MWNTs

本實(shí)驗(yàn)選擇體外評(píng)價(jià)方法(plasmid DNA assay)對(duì)MWNTs以及PEG修飾MWNTs的生物活性進(jìn)行研究.在納米材料對(duì)DNA的損傷過(guò)程中，最初的損傷表現(xiàn)為超螺旋DNA松弛(relaxed)，進(jìn)一步的損傷表現(xiàn)為DNA的線化(linearized).正常的質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度比松弛和線化的DNA快，故在智能凝膠成像系統(tǒng)所生成的圖像中能夠得到3條明顯分開(kāi)的條帶(見(jiàn)圖2).通過(guò)對(duì)圖2進(jìn)行分析，可以定量檢測(cè)不同的納米材料對(duì)質(zhì)粒DNA超螺旋部分的損傷程度［11］，并由此對(duì)納米材料的生物相容性作出相應(yīng)的評(píng)價(jià).

圖2 不同質(zhì)量濃度的MWNTs對(duì)質(zhì)粒DNA損傷的凝膠成像結(jié)果(μg/mL)Fig.2 Gel images of plasmid DNA damage by various concentration of MWNTs(μg/mL)

圖3為不同質(zhì)量濃度的CNTs對(duì)質(zhì)粒DNA損傷情況的定量分析結(jié)果.可以看出，當(dāng)原始單壁碳納米管 (single-walled CNTs，SWCNTs)質(zhì)量濃度為125 μg/mL時(shí)便開(kāi)始損傷質(zhì)粒DNA，并且隨著質(zhì)量濃度的增加，損傷程度也逐漸增加;當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2 000 μg/mL時(shí)，對(duì)質(zhì)粒DNA的損傷已非常明顯，可達(dá)48.6%.純化MWNTs對(duì)質(zhì)粒DNA的損傷較原始SWCNTs稍有減弱，低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的純化MWNTs對(duì)質(zhì)粒DNA超螺旋部分的損傷百分比處于一個(gè)較低的水平;但當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2 000 μg/mL時(shí)，純化MWNTs對(duì)質(zhì)粒DNA超螺旋部分的損傷也達(dá)到了21.1%，表明原始SWCNTs和純化MWNTs在達(dá)到一定質(zhì)量濃度時(shí)，對(duì)質(zhì)粒DNA都有較為明顯的損傷.而PEG修飾MWNTs對(duì)質(zhì)粒DNA的損傷明顯減弱，其損傷百分比一直處于一個(gè)非常低的水平;當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2 000 μg/mL時(shí)，PEG修飾MWNTs對(duì)質(zhì)粒DNA超螺旋部分的損傷也只有13.6%.

2.2 AFM實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

AFM在生物結(jié)構(gòu)的研究中具有如下獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：①可在納米水平上分辨生物大分子的結(jié)構(gòu)信息;②具有直觀的三維表面信息;③樣品制備相對(duì)簡(jiǎn)單，無(wú)需進(jìn)行染色、包埋等復(fù)雜處理過(guò)程;④可深入了解單個(gè)生物分子的三維結(jié)構(gòu)變化.越來(lái)越多的研究者利用AFM來(lái)研究DNA的結(jié)構(gòu)變化.Pang等［12］利用AFM研究了電子輻射導(dǎo)致水溶液中DNA斷裂的情況.Zhu等利用AFM觀測(cè)了Zn2+導(dǎo)致DNA扭曲的現(xiàn)象.本實(shí)驗(yàn)利用 AFM分別觀測(cè)了純pGBKT7質(zhì)粒結(jié)構(gòu)以及原始MWNTs、純化MWNTs和PEG修飾MWNTs對(duì)質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖4～圖7所示.

圖3 不同質(zhì)量濃度的CNTs溶液中質(zhì)粒DNA超螺旋部分的損傷情況Fig.3 Percentage of supercoiled DNA damage in CNTs solution at different mass concentration

圖4為純pGBKT7質(zhì)粒DNA的AFM圖像，可以清晰地看到，其完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)均勻地分布在云母片上，每個(gè)環(huán)狀質(zhì)粒的外徑約為85 nm，高度約為2 nm.

圖4 pGBKT7質(zhì)粒DNA的AFM圖像Fig.4 AFM images of pGBKT7 plasmid DNA

圖5為質(zhì)粒DNA與原始MWNTs混合培養(yǎng)后的AFM圖像.可以看出，未經(jīng)純化的原始MWNTs對(duì)質(zhì)粒DNA的損傷非常嚴(yán)重，絕大多數(shù)質(zhì)粒DNA失去了其完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA發(fā)生鏈斷裂變成了開(kāi)環(huán)的質(zhì)粒(open circular DNA，ocDNA)，還有一些質(zhì)粒DNA發(fā)生了更為嚴(yán)重的斷裂現(xiàn)象，即斷裂成小段并形成線化 DNA(linear DNA，lDNA).

圖5 pGBKT7質(zhì)粒DNA與原始MWNTs混合培養(yǎng)后的AFM圖像Fig.5 AFM images of pGBKT7 plasmid DNA after incubated with pristine MWNTs

圖6為質(zhì)粒DNA與純化MWNTs混合培養(yǎng)后的AFM圖像.可以看出，大部分質(zhì)粒DNA保持了原有的完整環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在與原始MWNTs共同培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的共價(jià)閉合環(huán)斷裂現(xiàn)象已經(jīng)得到了明顯的改善，線化的質(zhì)粒DNA較少，但質(zhì)粒DNA出現(xiàn)了扭曲現(xiàn)象，DNA間的糾結(jié)、纏繞現(xiàn)象也較為嚴(yán)重.由圖6可以明顯地看到，質(zhì)粒DNA在云母片上的分布不均勻，大量的質(zhì)粒DNA團(tuán)聚成一簇.

圖6 pGBKT7質(zhì)粒DNA與純化MWNTs混合培養(yǎng)后的AFM圖像Fig.6 AFM images of pGBKT7 plasmid DNA after incubated with purified MWNTs

圖7為質(zhì)粒DNA與PEG修飾MWNTs混合培養(yǎng)后的AFM圖像.可以明顯地看出，大部分的質(zhì)粒DNA完整地保存了其環(huán)狀結(jié)構(gòu)，基本上未出現(xiàn)開(kāi)環(huán)、線化和團(tuán)聚的現(xiàn)象，絕大多數(shù)環(huán)狀質(zhì)粒DNA均勻地分布在云母片上.AFM圖像中出現(xiàn)的管狀結(jié)構(gòu)為PEG修飾MWNTs，點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)為質(zhì)粒DNA，它們均勻地分布在云母片上，結(jié)構(gòu)非常完整.

圖7 pGBKT7質(zhì)粒DNA與PEG修飾MWNTs混合培養(yǎng)后的AFM圖像Fig.7 AFM images of pGBKT7 plasmid DNA after incubated with PEG-MWNTs

通過(guò)AFM的剖面分析觀測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)與各種MWNTs混合培養(yǎng)之后，質(zhì)粒DNA的外徑都有不同程度的收縮，純的質(zhì)粒DNA的直徑為80～90 nm，平均直徑約為85 nm.純化MWNTs與質(zhì)粒DNA共同培養(yǎng)后，質(zhì)粒DNA的收縮情況比較明顯，平均直徑收縮至50 nm左右.PEG修飾MWNTs與質(zhì)粒DNA共同培養(yǎng)后，質(zhì)粒DNA的收縮情況不明顯，平均直徑在75 nm左右.利用AFM中的長(zhǎng)度分析軟件，對(duì)每種外徑的縮小情況統(tǒng)計(jì)40個(gè)質(zhì)粒DNA，結(jié)果如表1所示.

表1 pGBKT7質(zhì)粒DNA與純化后的MWNTs，PEG修飾WMNTs混合培養(yǎng)后外徑測(cè)量Table 1 Outer mean diameters for ringlike plasmid DNA incubated with purified-MWNTs and PEG-MWNTs measured by AFM

AFM觀測(cè)得到的結(jié)果與電泳實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)論非常吻合.未經(jīng)純化處理的原始MWNTs對(duì)質(zhì)粒DNA的損傷較為嚴(yán)重，原因可能是原始MWNTs中含有的包括鐵、鈷、鎳等金屬顆粒雜質(zhì)對(duì)質(zhì)粒DNA產(chǎn)生了損傷.經(jīng)過(guò)純化的MWNTs，由于金屬催化劑和大部分的雜質(zhì)顆粒被除去，因而對(duì)質(zhì)粒DNA的損傷有所減弱，不會(huì)造成質(zhì)粒DNA的斷裂，但質(zhì)粒DNA發(fā)生了收縮和扭曲現(xiàn)象.經(jīng)過(guò) PEG修飾的MWNTs，由于其表面包裹了一層溶解性良好的高分子材料，體現(xiàn)出較好的生物相容性.其對(duì)質(zhì)粒DNA的損傷非常小，不會(huì)造成質(zhì)粒DNA的斷裂和扭曲，基本完好地保持了原有的形態(tài).

3 結(jié)束語(yǔ)

Plasmid DNA assay的研究結(jié)果表明，就對(duì)質(zhì)粒DNA的損傷程度而言，原始MWNTs＞純化MWNTs＞PEG修飾MWNTs.PEG修飾MWNTs具有較好的生物相容性，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2 000 μg/mL時(shí)，PEG修飾MWNTs對(duì)質(zhì)粒DNA超螺旋部分的損傷也只有13.6%;而在相同質(zhì)量濃度下，原始MWNTs和純化MWNTs對(duì)質(zhì)粒 DNA超螺旋部分的損傷分別為48.6%和21.1%.

AFM觀察的結(jié)果和plasmid DNA assay的結(jié)果非常吻合.原始MWNTs能夠造成大量的質(zhì)粒DNA分解、斷裂成線狀.純化MWNTs對(duì)質(zhì)粒DNA的形貌損傷有所減弱，大部分質(zhì)粒DNA保持了原有的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，但質(zhì)粒DNA的收縮、團(tuán)聚和纏繞現(xiàn)象非常明顯.PEG修飾MWNTs對(duì)質(zhì)粒DNA形貌的影響最弱，絕大多數(shù)質(zhì)粒DNA完好地保持了原有的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，質(zhì)粒的收縮現(xiàn)象不明顯.

［1］ KROTOH W，HEATHJ R，O’BRIENS C，et al.C60：buckminsterfullerene［J］.Nature，1985，318：162-163.

［2］ IIJIMAS.Helical microtubules of graphitic carbon［J］.Nature，1991，354：56-58.

［3］ SALVETATJ P，BONARDJ M，KULIKA J，et al.Mechanical properties of carbon nanotube［J］.Appl Phys A Mater，1999，69(3)：255-260.

［4］ TERSOFFJ，RUOFFR S.Structural properties of a carbon-nanotube crystal［J］.Phys Rev Lett，1994，73 (5)：676-679.

［5］ DALTONA B，COLLINSS，MUNOZE，et al.Supertough carbon-nanotube fibres—these extraordinary composite fibres can be woven into electronic textiles［J］.Nature，2003，423：703-705.

［6］ SENR，ZHAOB，PEREAD，et al.Preparation of singlewall carbon nanotube reinforced polystyrene and polyurethane nanofibers and membranes by electrospinning［J］.Nano Lett，2004，4：459-464.

［7］ WEBSTERJ J，WAIDM C，MCKENZIEJ L，et al.Nanobiotechnology： carbon nano-fibers as improved neural and orthopedic implants［J］.Nanotech，2004，15：48-54.

［8］ HUH，NIY，MONTANAV，etal.Chemically functionalized carbon nanotubes as substrates for neuronal growth［J］.Nano Lett，2004，4(3)：507-511.

［9］ GABAYT，JAKOBSE，BEN-JACOBEY，etal.Engineered selforganisation of neural networks using carbon nanotube clusters［J］.Physica，2005，350：611-621.

［10］ SUPRONOWIZP R，AJAYANP M，ULLMANK R，et al.Novel-current conducting composite substrates for exposing osetoblasts to alternating current stimulation［J］.J Biomed Mater Res，2002，59：499-506.

［11］ JIAG，WANGH，YANL，et al.Cytotoxicity of carbon nano materials： single-wall nanotube， multi-wall nanotube，and fullerene［J］.Environ Sci＆Technol，2005，39(5)：1378-1383.

［12］ PANGD，POPESCUG，RODGERSJ.Atomic force microscopy investigation of radiation-induced DNA double strand breaks［J］.Scanning Microscopy，1996，10(4)：1105-1110.