低溫時蛙皮素對IL-1β致熱大鼠的降溫作用及與PGE2的相關性

蛙皮素（bombesin，BN）是由14個氨基酸組成的神經(jīng)肽，廣泛存在于包括人在內(nèi)的哺乳動物體內(nèi)。動物研究表明，BN具有強烈的降溫作用[1]；BN的降溫作用與環(huán)境溫度密切相關，低溫下降溫作用更加顯著[2]。目前對BN的研究主要集中于環(huán)境溫度對其解熱作用的影響，而有關其解熱機制尚未做深入研究。

本室在先期研究中已經(jīng)證實，無論是白細胞介素-1β（IL-1β）性發(fā)熱的大鼠，還是腫瘤壞死因子 α（TNF-α）性發(fā)熱的大鼠，BN均可在常溫下通過抑制下丘腦中環(huán)磷酸腺苷（cAMP）[3-5]和PGE2[6]的升高來降低其發(fā)熱效應，且低溫下的降溫效應還與抑制cAMP的合成和釋放有關[7]。本實驗觀察了低溫下（4℃）側腦室注射BN對正常大鼠及IL-1β致熱大鼠體溫的作用，并檢測下丘腦組織、血漿PGE2含量的變化，以進一步探討低溫時BN的降溫作用及與PGE2含量的關系，完善BN的降溫機制研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠，健康♂，體重180～220 g，中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。室溫（20±2）℃，濕度（50±2）%，光照6：00～18：00，術后動物單籠飼養(yǎng)，自由進食、水。

1.1.2 藥物與試劑 BN（AnaSpec公司）；鹽酸氯氨酮（上海第一生化藥業(yè)公司）；鹽酸甲苯噻嗪（美國FAH公司）；IL-1β（北京寶賽公司）；PGE2放免測定試劑盒由上海中醫(yī)藥大學同位素室提供。

1.1.3 儀器 SN2202型數(shù)字溫度計（精確度0.1℃，北京師范大學司南儀器廠）；SN-2型立體定位儀（日本東京儀器廠）；GAMMA maticⅡ型γ放射免疫記數(shù)儀（瑞典Kontron公司）；LS-3801型液體閃爍記數(shù)儀（美國Beckman公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物體溫測量 數(shù)字溫度計探頭插入大鼠直腸6 cm，待數(shù)字穩(wěn)定后讀數(shù)（溫度探頭導線用膠條標記，避免操作中探頭插入深度的誤差）。實驗前連續(xù)7 d給大鼠測溫，以使其適應實驗者手法。實驗前1 h將大鼠放入4℃冰箱，測量體溫，以給藥前1 h測得的3次體溫的平均值作為大鼠給藥前基礎體溫，然后分別在給藥后各時間點記錄大鼠直腸溫。將實驗數(shù)據(jù)輸入計算機進行數(shù)據(jù)處理，獲得發(fā)熱的潛伏時、最大體溫反應高度（ΔT）和體溫反應指數(shù)（TRI3），利用這些數(shù)據(jù)做發(fā)熱標準曲線。

1.2.2 側腦室插管及側腦室給藥 大鼠在鹽酸氯氨酮和鹽酸甲苯噻嗪的聯(lián)合麻醉下，參照大鼠腦圖譜，用立體定位儀向一側側腦室置入一P10～P20組合的腦室插管，用牙科水泥固定，生理鹽水檢測小管通暢后封閉插管頂端。常規(guī)、單籠喂養(yǎng)1周后，開始實驗。經(jīng)插管給藥前，先將封閉的插管上端剪開，經(jīng)側腦室插管給藥時，要注意給藥速度保持一致（1 μl/s）。實驗結束后，檢查插管位置，舍掉插管位置不正確的數(shù)據(jù)。

1.2.3 實驗分組 SD♂大鼠26只，隨機分為4組，對照組用人工腦脊液10 μl/只，其余3組均用人工腦脊液配平至10 μl。見表1。

表1 實驗動物分組Tab.1 The groups of laboratory animals

1.2.4 樣品采集及PGE2含量測定 準備一次性空針吸取消炎痛-EDTA液約0.2 ml，根據(jù)體溫測定描繪的溫度曲線，分別在給藥后體溫峰值時脫臼法處死大鼠，于下腔靜脈穿刺取血4 ml，即刻在空針內(nèi)顛倒數(shù)次混勻，離心取上清，置－30℃冰箱中保存。以灰結節(jié)和視交叉的中心點為中心取下丘腦部組織即刻置液氮冷凍， 稱取 3～5mg置無水乙醇（0.4ml）+生理鹽水（1.6 ml）中勻漿（在冰浴中進行）、離心，將上清液吸出，置于-30℃冰箱中保存。PGE2含量的測定按試劑盒說明書進行操作。

1.3 體溫反應指標及數(shù)據(jù)處理

體溫反應指標用平均體溫反應曲線表示，體溫變化情況采用TRI3及ΔT表示，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IL-1β體溫反應曲線

向 SD♂大鼠側腦室微量注射 IL-1β（0.1 μg）后，30 min內(nèi)大鼠體溫迅速升高，90 min左右達發(fā)熱高峰[ΔT：（1.22±0.75）℃]，300 min 時出現(xiàn)第 2 個發(fā)熱高峰[ΔT：（0.95±0.32）℃]，發(fā)熱持續(xù)360 min開始下降。見圖1。

2.2 IL-1β、BN及BN+IL-1β體溫反應曲線

側腦室微量注射 BN（0.7 μg）后，體溫迅速下降，30 min時即出現(xiàn)明顯降低，45 min 時降至最低[ΔT：（1.93±0.30）℃]，然后開始回升。IL-1β的升體溫作用被預先給予的BN明顯抑制，說明4℃下BN能夠顯著抑制IL-1β的升體溫作用。見圖 2、表 2。

表2 大鼠微量注射給藥后的最大體溫變化（ΔT）及體溫反應指數(shù)（TRI3）（ ±s）Tab.2 Maximum body temperature change(ΔT)and TRI3 after micro-injection in rats( ±s)

表2 大鼠微量注射給藥后的最大體溫變化（ΔT）及體溫反應指數(shù)（TRI3）（ ±s）Tab.2 Maximum body temperature change(ΔT)and TRI3 after micro-injection in rats( ±s)

與對照組比較，*P＜0.01Compared with the control group,*P＜0.01

組別 只數(shù)對照組IL-1β組BN組BN+IL-1β組6686體溫反應指數(shù)（℃/h） 給藥后最大體溫變化（℃）0.95±0.63 3.28±1.78*3.22±1.29*3.42±0.70*0.39±0.28 1.22±0.75*1.99±0.99*1.78±0.74*

2.3 下丘腦及血漿PGE2含量

IL-1β組下丘腦和血漿PGE2含量與對照組相比均升高（P＜0.01、P＜0.01）；而 BN 組 PGE2含量則均低于對照組 （P＜0.01、P＜0.05）；在 BN+IL-1β 組 PGE2含量與 IL-1β 組相比均降低（均 P＜0.01）。見表 3。

表3 下丘腦和血漿中PGE2含量（ ±s）Tab.3 The content of PGE2in hypothalamus and plasma( ±s)

表3 下丘腦和血漿中PGE2含量（ ±s）Tab.3 The content of PGE2in hypothalamus and plasma( ±s)

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與 IL-1β 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with the IL-1β group,#P＜0.05,##P＜0.01

組別 只數(shù)PGE2含量下丘腦（pg/mg） 血漿（pg/ml）對照組IL-1β組BN組BN+IL-1β組6686 4 606.87±665.28 6 225.09±799.94**2 925.31±910.62**3 568.91±867.23##19 019.97±2 638.46 24 244.87±5 936.72*12 994.79±6 334.26*19 920.97±5 351.24#

3 討論

自1948年Beeson等發(fā)現(xiàn)內(nèi)生致熱原（EP）以來，40多年來人們對EP進行了系統(tǒng)深入的研究，取得了許多重要的進展[8]。學者們發(fā)現(xiàn)，許多外源性致熱原如細菌、內(nèi)毒素（ET）等并非直接作用于腦，而是通過激活產(chǎn)生EP的細胞，使后者產(chǎn)生和釋放EP，EP再以某種方式引起發(fā)熱。其中EP如何引起發(fā)熱是人們關注的焦點。有學者推斷EP可能是作用于PO/AH區(qū)，使體溫調(diào)定點上移，產(chǎn)生發(fā)熱反應[9]。有資料表明，多種物質可能在中樞參與或影響發(fā)熱，如單胺類物質、CRH、棕色脂肪組織以及cAMP等[10-11]。近年來，PGE、中樞Ca2+以及阿片類物質的中介作用也受到了人們的關注[12-13]。

PGE2是否是發(fā)熱的中樞介質在國內(nèi)外一存在有爭議。目前，許多研究者在對PGE2與發(fā)熱關系的研究中，都試圖通過EP或ET致熱后中樞PGE2含量增加與否來說明其是否為中樞發(fā)熱介質。以往的實驗表明，在外周EP性發(fā)熱的同時，腦脊液內(nèi)PGE2的含量明顯增加[12]。支持者認為是因為EP作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，使其合成、釋放PGE2增加而使調(diào)定點上移，引起體溫升高，但尚無足夠的證據(jù)證明EP能透過血-腦屏障，而且對IL-1能否自外周血進入腦內(nèi)的驗證取得陰性結果[14]?，F(xiàn)在提出了新的假說，認為PGE的釋放部位是在下丘腦終板血管區(qū)（OVLT）的有孔毛細血管外周的巨噬細胞，被EP激活的巨噬細胞釋放PGE，后者作用于OVLT的神經(jīng)元，或透過室管膜細胞的緊密連接而作用于POAH的神經(jīng)元；也有一些資料不支持該假說。

本實驗結果表明，低溫下側腦室注射IL-1β引起大鼠體溫升高的同時，其下丘腦及血漿中PGE2的含量也均升高；低溫下側腦室注射BN可明顯降低大鼠正常體溫的同時，其下丘腦及血漿中PGE2的含量也隨之降低；低溫下側腦室注射BN，明顯抑制了大鼠IL-1β性發(fā)熱反應的同時，其下丘腦及血漿中PGE2的含量也均降低。該結果較好地支持了以往爭議中有關PGE2作為中樞發(fā)熱介質的主張；提示低溫下BN可能通過抑制PGE2的合成與釋放降低大鼠正常體溫和抑制IL-1β的致熱效果。

目前，國內(nèi)外對BN的體溫調(diào)節(jié)作用多數(shù)停留在降溫現(xiàn)象的描述階段，未對BN的作用機制和新型解熱藥物的開發(fā)做進一步研究。我們通過研究低溫下BN降溫及翻轉IL-1β致熱作用與PGE2的關系為BN降溫作用機制的闡明積累了資料。BN作用后下丘腦、血漿中PGE2含量顯著降低，說明PGE2不僅可通過其含量的增加而在發(fā)熱過程中起重要作用，也可在致冷原的作用下通過其含量的降低而起到降溫作用。這可能是低溫下BN降低體溫的機制之一。

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