蠶蛹蟲草多糖對氫化可的松致小鼠肝損傷的保護(hù)作用

鄭賢林，李有貴，鐘 石，李增智，計(jì)東風(fēng)

(1.安徽省微生物防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江 杭州 310021)

蠶蛹蟲草多糖對氫化可的松致小鼠肝損傷的保護(hù)作用

鄭賢林1，2，李有貴2，鐘 石2，李增智1，計(jì)東風(fēng)2

(1.安徽省微生物防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江 杭州 310021)

研究用蠶蛹蟲草多糖連續(xù)灌胃21 d，治療肌注可的松的小鼠的效果，結(jié)果表明，小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、肝組織丙二醛 (MDA)含量顯著降低，抗氧化劑超氧化物歧化酶 (SOD)、還原型谷胱甘肽 (GSH)水平顯著升高，病理切片檢查發(fā)現(xiàn)氫化可的松引起的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、肝竇瘀血及肝索排列紊亂等病理癥狀得到減輕，說明蠶蛹蟲草多糖對氫化可的松致小鼠肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。

蠶蛹蟲草;多糖;氫化可的松;小鼠;肝損傷

蛹蟲草又名北冬蟲夏草、北蛹蟲草、蟲草等。蛹蟲草為子囊菌亞門，麥角菌目，麥角菌科，蟲草屬。蛹蟲草的藥用價(jià)值與保健價(jià)值和冬蟲夏草相似，為我國特有的一類珍貴藥用真菌［1］。蟲草多糖作為蟲草的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗炎癥和免疫調(diào)節(jié)等功能［2］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，南沙參多糖［3］、玉郎傘多糖［4］、金針菇多糖［5］、牛膝多糖［6］等對動物化學(xué)性和免疫性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。外源性糖皮質(zhì)激素氫化可的松 (HC)造成的動物模型，其病理改變集中發(fā)生在肝、腎、腦、胸腺、脾等器官［7］。實(shí)驗(yàn)以氫化可的松致肝損傷小鼠為對象，通過觀察蠶蛹蟲草多糖對小鼠血清、肝臟中一些生化指標(biāo)的影響，結(jié)合小鼠肝臟病理變化，探討蠶蛹蟲草多糖對氫化可的松致肝損傷小鼠的保護(hù)效果及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品

蠶蛹蟲草多糖。將活化的青海蟲草液體菌種(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供)接種于固體培養(yǎng)基(蠶蛹∶玉米面 ∶營養(yǎng)液為 4∶1∶9，營養(yǎng)液:蔗糖 20 g·L－1+蛋白胨 3 g·L－1+ 瓊脂 15 g·L－1+ 復(fù)合維生素 0.04 g·L－1+MgSO41 g·L－1+KH2PO41 g·L－1)上，按菌液∶培養(yǎng)基 =1∶5比例接種，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，采集培養(yǎng)基表面菌絲體，烘干粉碎，加定量蒸餾水90℃水浴提取4 h，過濾得上清液，加3倍的95%乙醇4℃靜置過夜，12 000 r·min－1離心10 min，取沉淀用蒸餾水溶解凍干，得蠶蛹蟲草多糖。氫化可的松注射液購自山西晉新雙鶴藥業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及環(huán)境

ICR小鼠，雄性，體重 (30±2)g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供 (動物飼養(yǎng)合格證號:SCXK浙2008－0033)。環(huán)境清潔級，溫度(25±2)℃，相對濕度50% ～70%，自然光照，自由取食與飲水，預(yù)試期7 d。

1.3 主要試劑與儀器

主要試劑有超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽 (GSH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)以及考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。儀器有infinite M200酶標(biāo)儀;Leica-DM2500微生物顯微鏡 (德國，Leica公司)。

1.4 動物造模及用藥劑量

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組 (正常對照組，模型組，蠶蛹蟲草多糖低、高劑量組(0.2和0.4 g·kg－1))，每組15只。除正常組外，其他各組小鼠每只皮下注射氫化可的松25mg·kg－1，隔日1次，共5次，正常對照組注射等容量生理鹽水。末次注射24 h后，按下述分組分別灌藥，對照組和模型組每天灌胃0.3 mL生理鹽水，蠶蛹蟲草多糖給藥組每天灌胃0.3 mL相應(yīng)劑量的蠶蛹蟲草多糖 (0.2和0.4 g·kg－1)，連續(xù)灌胃21 d。

1.5 檢測動物處理方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前禁食12 h，各組隨機(jī)抽取10只小鼠，摘眼球取血，4℃密封靜置 2 h，3 500 r·min－1離心 15 min，取血清，4℃密封保存待檢。同時(shí)迅速剖取肝臟，冰生理鹽水沖洗、濾紙吸濕后，稱取鮮質(zhì)量0.3 g左右，加預(yù)冷生理鹽水，冰水中制成10%勻漿，4℃下12 000 r·min－1離心5 min，取上清液，按試劑盒要求保存待檢。

1.6 小鼠血清、肝勻漿的生化指標(biāo)檢測

AST、ALT、SOD、MDA、GSH以及考馬斯亮藍(lán)蛋白測試按試劑盒說明書測定。

1.7 小鼠肝臟組織切片標(biāo)本制備

距肝臟邊緣0.5 cm處取材，10%甲醛固定后，逐級乙醇脫水、透明、浸臘、包埋、切片，HE染色。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠血清AST和ALT活性

由表1可見，氫化可的松致肝損傷模型小鼠血清AST和ALT活性顯著升高，灌胃給予蠶蛹蟲草菌絲體多糖后，可使肝損傷小鼠血清AST和ALT活性顯著下降，且呈劑量相關(guān)性，其中高劑量菌絲體多糖組 (0.4 g·kg－1)血清 AST、ALT水平與正常組無顯著差異。

2.2 小鼠血清GSH、肝臟SOD、MDA水平

表1 試驗(yàn)小鼠血清AST和ALT活性的變化

氫化可的松可造成模型小鼠血清抗氧化劑GSH含量明顯下降，肝臟抗氧化酶SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高;蠶蛹蟲草多糖可顯著提高肝損傷小鼠血清GSH的含量和肝臟總抗氧化酶SOD活性，降低肝臟MDA含量至正常水平(表2)。

表2 試驗(yàn)小鼠血清GSH、肝臟總SOD酶活性及MDA含量比較

2.3 小鼠肝組織病理變化

病理檢查結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，無變性、壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，細(xì)胞核清晰，肝竇正常 (圖1中A)。氫化可的松致肝損傷模型小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)病變，肝索排列紊亂，細(xì)胞間無明顯分界，肝竇瘀血，肝細(xì)胞廣泛性空泡變性，呈典型的氣球樣變 (圖1中B)。蠶蛹蟲草多糖低劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，肝索部分排列整齊，部分細(xì)胞間仍無明顯分界，相對模型組有明顯好轉(zhuǎn) (圖1中C)。高劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，細(xì)胞核較清晰，肝竇無明顯異常，但有少量充血 (圖1中D)。

3 小結(jié)與討論

皮質(zhì)激素氫化可的松造模是應(yīng)用最廣泛的造模方法，大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，皮質(zhì)激素動物模型幾乎全身所有系統(tǒng)均產(chǎn)生變化，廣泛的器官病理損害，脂質(zhì)過氧化物增加和自由基清除系統(tǒng)功能低下等［8］。AST和 ALT是肝損傷的標(biāo)志酶，在正常條件下，這些酶主要存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時(shí)就會釋放入血，故血清中AST和ALT酶活性的升高為反映肝功能受損的特異性指標(biāo)［9－10］。病理切片發(fā)現(xiàn)氫化可的松可造成小鼠肝索排列紊亂，細(xì)胞間無明顯分界，肝竇瘀血等病變［11］。本實(shí)驗(yàn)從血清學(xué)和肝組織理學(xué)2方面說明小鼠肝損傷造模成功。

圖1 蠶蛹蟲草多糖對氫化可的松致肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響 (HE×10)

前期的研究發(fā)現(xiàn)許多多糖具有顯著的肝功能保護(hù)作用［12］。孫延鵬［13］等研究發(fā)現(xiàn)山藥多糖可降低血清中AST和ALT活性，對免疫性肝損傷小鼠具有保護(hù)作用。陳旭等［14］發(fā)現(xiàn)桃金娘多糖對 D-半乳糖胺致大鼠急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氫化可的松可導(dǎo)致小鼠血清AST和ALT活性顯著升高，說明模型小鼠肝損傷明顯;灌胃給予蠶蛹蟲草菌絲體多糖后，可使肝損傷小鼠血清AST和ALT活性顯著下降，且呈劑量相關(guān)性，其中高劑量菌絲體多糖組 (0.4 g·kg－1)血清AST、ALT水平與正常組無顯著差異，說明蠶蛹蟲草多糖對氫化可的松致小鼠肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。

脂質(zhì)過氧化是機(jī)體分子氧在氧化代謝過程中形成的活性氧中間產(chǎn)物，是對生物膜磷脂中多不飽和脂肪酸攻擊引起的細(xì)胞損傷過程［15］。MDA是反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平的重要指標(biāo)，其能與蛋白質(zhì)的巰基反應(yīng)，導(dǎo)致被修飾的蛋白質(zhì)和酶失去生物活性，而SOD和GSH是機(jī)體內(nèi)2個(gè)關(guān)鍵的抗氧化劑［15］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，氫化可的松在引起脂質(zhì)過氧化同時(shí)，減弱體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化酶 (SOD)的活性及GSH含量，致使大量自由基無法清除，MDA水平顯著升高，進(jìn)而引起肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能損傷;蟲草多糖可明顯提高抗氧化劑 (SOD、GSH)的水平，降低MDA含量，從而減輕了因脂質(zhì)過氧化加劇而造成的肝細(xì)胞損傷。肝臟石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)蠶蛹蟲草多糖明顯減輕了氫化可的松引起的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、肝竇淤血及肝索排列紊亂等病理變化，顯示出對氫化可的松造成的肝細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步了解蛹蟲草多糖對肝損傷保護(hù)機(jī)制以及蛹蟲草的深度開發(fā)提供了基礎(chǔ)信息。

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S 886.9

A

0528-9017(2011)03-0702-03

文獻(xiàn)著錄格式:鄭賢林，李有貴，鐘石，等.蠶蛹蟲草多糖對氫化可的松致小鼠肝損傷的保護(hù)作用 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(3):702－705.

2011-03-05

浙江省重大科技攻關(guān)項(xiàng)目 (2004C14009)

鄭賢林 (1986－)，男，江西萍鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事蟲生真菌研究工作。

注:計(jì)東風(fēng)系通信作者，E-mail:xianlin_1986@163.com。

(責(zé)任編輯:張才德)