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      扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠急性肺損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究*

      2011-01-31 08:14:08王丁超蘇秀平吳桂玲陳曉敏
      中國中醫(yī)急癥 2011年10期
      關(guān)鍵詞:烏司扶正膿毒癥

      張 韌 王丁超 蘇秀平 高 翔 王 靜 吳桂玲 陳曉敏

      1河南省濮陽市中醫(yī)院(河南濮陽457003)

      2河南省中醫(yī)院(河南鄭州450008)

      急性肺損傷(ALI)是臨床上常見的急性呼吸系統(tǒng)功能失常,其中由感染導(dǎo)致的膿毒血癥是引起ALI的最常見的病因。目前認(rèn)為膿毒癥是炎癥失控導(dǎo)致的紊亂,是機(jī)體對微生物產(chǎn)物發(fā)生失控的免疫反應(yīng)[1],其中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是膿毒癥發(fā)生早期的重要炎性細(xì)胞因子,大量釋放則對機(jī)體造成損傷,白細(xì)胞介素-1(IL-1)可與 TNF-α 協(xié)同作用加重多器官損傷[2]。 本實(shí)驗(yàn)以膿毒癥大鼠為研究對象,觀察大鼠不同時間點(diǎn)的肺組織含水量、動脈血?dú)庾兓⒎谓M織IL-1、TNF-α表達(dá)變化,探討中藥復(fù)方扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠肺損傷的保護(hù)作用。

      1 材 料

      1.1 實(shí)驗(yàn)動物 青年SD大鼠,清潔級,雌雄各半,鼠齡3~4月,體質(zhì)量(300±50)g,154只。 由河南實(shí)驗(yàn)動物中心提供,合格證號:scxk(豫)2009-0006。

      1.2 藥品與儀器 扶正敗毒顆粒(濮陽市中醫(yī)院中藥制劑室提供);烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn),批號:國藥準(zhǔn)字 S19990050);IL-1單克隆抗體及TNF-α單克隆抗體均由武漢博士德生物工程有限公司提供。光學(xué)顯微鏡(Olympus optical Co.LTD,JAPAN,型號 PM-10AD)。電子天平(上海精科天平廠,型號 JA1203)。

      1.3 分組與造模 將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、扶正敗毒顆粒組、烏司他丁組及扶正敗毒顆粒聯(lián)合烏司他丁聯(lián)合組(聯(lián)合組)各36只,假手術(shù)組10只。參考文獻(xiàn)[3-4]加以改良制備膿毒癥動物模型。水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,待完全麻醉后,仰臥位固定大鼠,頸部皮膚常規(guī)備皮、消毒,于頸外側(cè)下頜至心臟的中點(diǎn)作一約1cm的橫切口,鈍性分離皮下組織,暴露右側(cè)頸外靜脈,沿血管向近心端方向插入留置針約1cm,將導(dǎo)管從留置針管與頸外靜脈夾孔中把心導(dǎo)管慢慢置入達(dá)右心房,結(jié)扎固定,導(dǎo)管末端經(jīng)皮下隧道從頸后中央引出并固定于皮膚,管內(nèi)注射125U/mL肝素0.5mL抗凝,插入置管針封閉導(dǎo)管。然后沿腹白線中段作3cm切口,探查取出盲腸,用4號絲線距盲端1cm處結(jié)扎,用12號針穿刺3孔,擠出少許糞便于腹腔內(nèi),回納盲腸,分層縫合腹腔。手術(shù)過程中保持大鼠肛溫(37.0±0.5)℃,保持室溫(26.0±1.0)℃。

      1.4 給藥方法 假手術(shù)組、模型組、烏司他丁組分別于造模后第1日用生理鹽水灌胃,同時扶正敗毒顆粒組、聯(lián)合組用扶正敗毒顆粒(36.8mg/100g)灌胃(灌胃容積為1mL/100g),每日灌胃1次直至取材;烏司他丁組、聯(lián)合組大鼠分別于造模后第1日腹腔內(nèi)注射烏司他?。?萬U/㎏),假手術(shù)組、模型組、扶正敗毒顆粒組同時用同等容積的生理鹽水腹腔注射,每日1次直至取材。

      1.5 標(biāo)本采集與檢測 (1)腹主動脈血?dú)猓簻y定大鼠口腔溫度,并記錄,取腹主動脈血2mL采用電極法進(jìn)行血?dú)鉁y定,PaO2、PaCO2。(2)肺組織含水量:稱取肺組織濕重,然后放入恒溫箱(100±2℃)干燥,24h后取出,稱取干重,計(jì)算肺組織含水量。計(jì)算公式:肺組織含水量=(肺濕重-肺干重)/肺濕重×100%,以%表示。(3)臟器組織IL-1,TNF-α表達(dá):檢測采用免疫組織化學(xué)SP法檢測,在400倍光鏡下觀察,細(xì)胞膜、細(xì)胞漿呈棕色為免疫組化陽性;用Image-Pro Plus 5.1專業(yè)圖像采集與分析系統(tǒng)采集圖像,并進(jìn)行半定量分析,每張切片隨機(jī)選取不重疊的5個視野拍照,測定其平均吸光度及陽性細(xì)胞數(shù),取其平均值代表各細(xì)胞因子的表達(dá)水平。(4)病理觀察:取肺組織4%多聚甲醛固定,經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋,切成4~6μm厚的切片,常規(guī)脫蠟、脫水,蘇木素-伊紅(HE)染色,脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡觀察肺、腸組織病理形態(tài)學(xué)改變。

      1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用單因素方差分析方法,數(shù)據(jù)以s)表示;組內(nèi)差異比較采用單因素方差分析兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié) 果

      2.1 各組大鼠動脈血PaO2、PaCO2比較 見表1。與假手術(shù)組比較,模型組動脈血 PaO2顯著降低,PaCO2顯著升高(P<0.01);與模型組比較,扶正敗毒顆粒和烏司他丁及聯(lián)合組PaO2升高,PaCO2下降,以聯(lián)合7d組尤為顯著(P<0.01);與扶正敗毒顆粒通組比較,烏司他丁組無顯著差異(P>0.05),見表1。

      表1 各組大鼠動脈血PaO2、PaCO2比較 (mmHg,

      表1 各組大鼠動脈血PaO2、PaCO2比較 (mmHg,

      與假手術(shù)組比較,△P<0.05,△△P<0.01; 與模型組比較,◇P<0.05,◇◇P<0.01;與扶正敗毒顆粒組比較,▽P<0.05;與聯(lián)合組比較,〇P<0.05,〇〇P<0.01;與 2d組比較,□P<0.05,□□P<0.01;與 3d組比較,*P<0.05,*P<0.01。 下同。

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      2.2 肺組織含水量變化結(jié)果 見表2。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠肺組織含水量顯著升高(P<0.01);與模型組比較,扶正敗毒顆粒和烏司他丁及聯(lián)合組含水量均顯著降低 (P<0.05或0.01),與2d、3d組相比,扶正敗毒顆粒和烏司他丁7d組的肺組織含水量均顯著降低(P<0.05或0.01),以聯(lián)合7d組下降尤為顯著(P<0.01)。

      表2 各組大鼠含水量比較(

      表2 各組大鼠含水量比較(

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      2.3 肺組織TNF-α、IL-1的表達(dá)變化 見表3。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-1表達(dá)均升高 (P<0.05或0.01);與模型組相比,扶正敗毒顆粒和烏司他丁及聯(lián)合組各時間點(diǎn) TNF-α、IL-1的表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05或 0.01),以聯(lián)合7d組的尤為顯著(P<0.01);與聯(lián)合組相比,扶正敗毒顆粒組和烏司他丁組TNF-α、IL-1表達(dá)水均顯著升高 (P<0.05或0.01),以 2d組尤為顯著(P<0.01)。與 2d 、3d組相比,以聯(lián)合 7d組 TNF-α、IL-1 表達(dá)水平下降尤為顯著(P<0.01)。

      表3 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1陽性細(xì)胞表達(dá)變化(IOD,

      表3 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1陽性細(xì)胞表達(dá)變化(IOD,

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      2.4 肺組織病理改變 假手術(shù)組大鼠肺組織可見肺泡大一致,肺泡壁菲薄,支氣管上皮完整,管腔內(nèi)無分物,支氣管上皮正常,外周無炎性細(xì)胞浸潤。模型2d組可見肺間質(zhì)有單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸,肺組織出現(xiàn)散在性病灶;3d組可見病灶增大、數(shù)量多,肺泡壁廣泛淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤,有些區(qū)域可見肺泡出血,肺泡壁結(jié)構(gòu)不清。7d組更為明顯,肺泡腔內(nèi)滿布炎性滲出物、血性滲出物明顯,大量上皮脫落,肺泡壁結(jié)構(gòu)不清,大片的肺實(shí)變。扶正敗毒顆粒組在第2、3、7日均較模型組有顯著改善,病變范圍、程度均較模型組明顯減輕。聯(lián)合7d組改善尤為顯著,表現(xiàn)為病變范圍較局限,炎細(xì)胞密度較低,肺泡腔內(nèi)滲出物少,肺泡結(jié)構(gòu)較模型組完整。

      3 討 論

      ALI主要是因機(jī)體炎癥反應(yīng)失控所導(dǎo)致的器官損傷[5]。本組資料顯示模型組大鼠肺組織炎性因子TNF-α,IL-1表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組,表明促炎細(xì)胞因子在膿毒癥大鼠急性肺損傷損傷中發(fā)揮了重要作用。TNF-α是由活化的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,具有核心作用,是導(dǎo)致炎癥介質(zhì)級聯(lián)反應(yīng)的始發(fā)因子。一旦TNF-α被分泌出來,炎癥連鎖反應(yīng)即被啟動,促進(jìn)其他細(xì)胞因子的激發(fā)釋放,引起組織損害。有報(bào)道促炎癥細(xì)胞因子TNF-α在感染性休克中發(fā)揮關(guān)鍵作用,直接導(dǎo)致某些臟器的損傷[6]。IL-1是另一種主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子,是體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的中心介質(zhì),是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子,能激活多種免疫和炎癥細(xì)胞:刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和TNF-α;刺激中性粒細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì);誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化,與TNF-α協(xié)同作用,促進(jìn)血管內(nèi)皮-白細(xì)胞黏附分子的表達(dá),趨化中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞進(jìn)人病變部位,增加血管內(nèi)皮通透性,加重組織損傷[7-8]。所以,降低促炎細(xì)胞因子TNF-α,IL-1水平對防止ALI具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,扶正敗毒顆粒能夠降低組織炎性因子TNF-α,IL-1表達(dá)水平,提示扶正敗毒顆粒通過降低臟器組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α,IL-1含量,進(jìn)而減輕膿毒癥大鼠多器官損傷和降低死亡率。

      綜上所述,促炎因子TNF-α,IL-1在ALI中發(fā)揮了重要作用,扶正敗毒顆粒能夠降低臟器組織中TNF-α,IL-1表達(dá)水平以減輕臟器損傷;降低了肺組織的含水量,提高動脈血氧含量,對膿毒癥大鼠具有確實(shí)的防護(hù)作用,為扶正敗毒顆粒防治膿毒癥性MODS提供了參考。

      [1] SatSharma,MD,F(xiàn)RCPC,etal.Septic shock multiple organ failure and acute respiratory distresss yndrome[J].Medseape,2003,9(12):199-209.

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