精索靜脈曲張對(duì)青春期大鼠性激素以及其睪丸受體的影響

李超鵬 ，張 端 ，史婷婷 ，張雁鋼 ?

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥理學(xué)教研室，山西太原 030001

精索靜脈曲張（varicocele，VC）是青壯年男性常見的疾病，是因精索靜脈血流淤積而造成精索蔓狀叢（靜脈血管叢）血管擴(kuò)張、迂曲變長(zhǎng)。發(fā)病率男性人群為10%～15%，以左側(cè)發(fā)病為多。Trussell等[1]研究發(fā)現(xiàn)，77.5%的不育患者有不同程度的雙側(cè)精索靜脈曲張，15.5%的患者伴有單側(cè)精索靜脈曲張。VC可伴有睪丸萎縮、精子生成障礙和精液異常。有明確的證據(jù)表明VC對(duì)睪丸的損害隨時(shí)間進(jìn)展而累積，并最終導(dǎo)致不育的發(fā)生[2]。Boucher等[3]研究發(fā)現(xiàn)伴有精索靜脈曲張的不育患者精子發(fā)生和間質(zhì)細(xì)胞功能障礙并伴有垂體功能亢進(jìn)。對(duì)于VC引起不育的機(jī)制的研究主要集中在陰囊高溫、代謝產(chǎn)物反流、下丘腦-垂體軸功能不足、睪丸局部缺氧、DNA損傷等方面[4]。本研究通過建立青春期大鼠實(shí)驗(yàn)性左側(cè)精索靜脈曲張（experimental left varicocele，EV）模型，探討 VC對(duì)大鼠性激素及其受體的影響，揭示性激素及性腺軸功能障礙對(duì)大鼠生精功能的可能影響，為VC導(dǎo)致不育的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大鼠的青春期通常為（50±10）d，選擇鼠齡6周、體重110～130 g的Wistar雄性大鼠作為青春期大鼠，由山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室動(dòng)物房提供。

1.2 動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

10%水合氯醛腹腔注射麻醉，部分結(jié)扎左腎靜脈。具體方法如下：取腹部正中切口，游離左腎靜脈，在左腎上腺靜脈和睪丸靜脈內(nèi)側(cè)、腎靜脈匯入下腔靜脈處，置一根直徑為0.55 mm的金屬桿，與左腎靜脈一起結(jié)扎，借此使左腎靜脈直徑縮小約1/2。結(jié)扎后將金屬桿拔出，可見部分結(jié)扎的左腎靜脈迅速擴(kuò)張。3-0絲線縫合切口。對(duì)照組游離左腎靜脈，但不結(jié)扎。

實(shí)驗(yàn)分組：共對(duì)18只大鼠進(jìn)行左腎靜脈結(jié)扎手術(shù)，隨機(jī)分為三組，每組各6只，術(shù)后2、4、8周均檢測(cè)血清性激素及取睪丸組織。對(duì)照組18只，隨機(jī)分為三組，與相應(yīng)手術(shù)組做相同處理。以精索靜脈最大徑大于1 mm、左腎無(wú)缺血萎縮為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 標(biāo)本采集

分別于術(shù)后2、4、8周取大鼠睪丸組織，一部分研磨，制成組織勻漿（w/v=1∶9），剩余部分用 Bouin′s 液固定 24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，蠟塊包埋。于晨9時(shí)至11時(shí)下腔靜脈取靜脈血，離心后取血清，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 標(biāo)本處理方法

1.4.1 HE染色 切片，厚度為4 μm，脫蠟，蘇木素-伊紅（HE）染色、脫水、封片。光鏡下觀察各組大鼠睪丸組織及生精上皮變化。

1.4.2 放射免疫方法 應(yīng)用放射免疫法測(cè)定睪丸組織睪酮濃度（intratesticular testosterone concentration，ITC）及血清卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）含量，試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供，具體操作步驟均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3 免疫組化方法 切片厚度為4 μm，采用SP法進(jìn)行免疫組化染色，切片脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育15 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清37℃封閉15 min，抗原修復(fù)，兔抗大鼠 AR、FSHR、LHR 抗體（1∶100）4℃過夜，恢復(fù)至室溫，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，37℃孵育15 min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37℃孵育15 min，以上各步驟間用pH 7.4的PBS緩沖液洗3次，每次3 min；DAB顯色3～10 min，自來水終止顯色；蘇木素復(fù)染1 min，鹽酸酒精浸泡5 s，氨水5 s，常規(guī)脫水，透明，封片。用PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，其余步驟同前。結(jié)果用圖像分析軟件BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠睪丸AR、FSHR和LHR免疫組化灰度值進(jìn)行測(cè)量和分析，每張切片（400×）隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞平均灰度值，平均灰度值越低表示免疫反應(yīng)陽(yáng)性越強(qiáng)。

1.4.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法 切取4 μm厚睪丸組織石蠟切片，脫蠟、脫水、透明，其余步驟按試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL（試劑盒由北京中山金橋公司提供）染色法行細(xì)胞凋亡檢測(cè)（加POD前在熒光顯微鏡下分析結(jié)果并拍照），細(xì)胞核染成棕色者為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，光鏡下（400×）每張切片選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算凋亡細(xì)胞所占生精細(xì)胞的百分率作為生精細(xì)胞的凋亡指數(shù)（AI）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

對(duì)照組睪丸組織中生精上皮基膜完整，各期生精細(xì)胞排列有序，層次清楚，管腔里有大量精子。2周實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組無(wú)明顯變化。4周實(shí)驗(yàn)組睪丸生精上皮基膜變薄，各級(jí)生精細(xì)胞減少，結(jié)構(gòu)稀疏，管腔中精子數(shù)量減少，小管間隙變寬，間質(zhì)細(xì)胞減少。8周實(shí)驗(yàn)組生精上皮基膜破裂溶解，各級(jí)生精細(xì)胞排列紊亂、數(shù)量減少，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞體積縮小，管腔中可見脫落的不成熟生精細(xì)胞，成熟精子細(xì)胞減少，間質(zhì)水腫，間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步減少。

2.2 放射免疫結(jié)果

見表1。

2.3 免疫組化結(jié)果

特異性AR免疫染色可見AR主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，其他可見于支持細(xì)胞、肌樣細(xì)胞、精原細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞；FSHR主要表達(dá)于支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)；LHR主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜，間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)也有少量表達(dá)。其結(jié)果見表2。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

2周實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞主要為間質(zhì)細(xì)胞，可見少量初級(jí)精母細(xì)胞凋亡；4周實(shí)驗(yàn)組可見間質(zhì)細(xì)胞凋亡，曲細(xì)精小管中除精原細(xì)胞外，其他各級(jí)細(xì)胞都出現(xiàn)凋亡；8周實(shí)驗(yàn)組可見間質(zhì)細(xì)胞明顯減少，曲細(xì)精小管中除精原細(xì)胞外，其他各級(jí)細(xì)胞都出現(xiàn)凋亡，管腔變薄，細(xì)胞層次紊亂，管腔中可見大量凋亡的分裂晚期的精子細(xì)胞。對(duì)照組中可見少量凋亡細(xì)胞，主要集中在次級(jí)精母細(xì)胞及分裂期的精子細(xì)胞。兩組凋亡結(jié)果見表3。

3 討論

精索靜脈曲張是青壯年男性常見病，是男性不育的重要因素，但精索靜脈曲張與男性不育的確切關(guān)系目前尚無(wú)定論。研究發(fā)現(xiàn)，精索靜脈曲張可致患者性激素分泌紊亂并可致下丘腦-垂體-性腺軸功能障礙，而性激素對(duì)生精功能有重要調(diào)控作用。睪酮主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌，受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)控制。睪酮的主要功能之一就是維持生精作用，如果睪酮分泌減少，精子發(fā)生過程將停滯在初級(jí)精母細(xì)胞階段；FSH和LH均由腺垂體分泌，對(duì)生精過程均有調(diào)控作用。FSH對(duì)生精過程有啟動(dòng)作用，而睪酮對(duì)生精過程有維持效應(yīng)；LH對(duì)生精過程的調(diào)節(jié)作用不是直接影響生精細(xì)胞，而是通過刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮而間接發(fā)生作用[5]。Li-Ming等[6]研究精索靜脈曲張伴不育的患者時(shí)，發(fā)現(xiàn)行精索靜脈曲張切除術(shù)后可顯著提高患者的血清睪酮濃度，雖然升高患者的血清T濃度并不一定能夠直接改善患者精液質(zhì)量，但是可以改善患者激素分泌和生精功能。Cayan等[7]發(fā)現(xiàn)行精索靜脈曲張切除術(shù)后可改善支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞功能，顯著降低患者的FSH和提高患者的血清T濃度，并可提高精子濃度和活力。T、FSH和LH都是通過與其相應(yīng)的受體結(jié)合后發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)試圖通過精索靜脈曲張對(duì)性激素、激素受體及性腺軸的影響來解釋大鼠生精功能降低的發(fā)生過程和機(jī)制。

表1 各組大鼠左側(cè)睪丸ITC和血清性激素濃度（ ±s）Tab.1 ITC and serum sex hormone concentrations of the left testis in rats of all groups( ±s)

表1 各組大鼠左側(cè)睪丸ITC和血清性激素濃度（ ±s）Tab.1 ITC and serum sex hormone concentrations of the left testis in rats of all groups( ±s)

注：相同時(shí)間段內(nèi)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有差異（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M內(nèi)不同時(shí)間段比較，▲與2周組比較有差異（P＜0.05）；★與4周組比較有差異（P＜0.05）Note：◆ there was significant differences between experiment group and control group （P＜0.05）;▲ there were significant differences compared with the 2-weeks group in experiment group or control group (P＜0.05),★ there were significant differences compared with the 4-weeks group (P＜0.05)in experiment group or control group

分組 只數(shù) 睪丸組織中睪酮濃度（nmol/L）血清睪酮濃度（nmol/L）卵泡刺激素濃度（ng/ml）黃體生成素濃度（ng/ml）對(duì)照組2周組4周組8周組實(shí)驗(yàn)組2周組4周組8周組666 666 9.32±1.71 9.51±1.50 9.48±1.45 1.07±0.28 1.12±0.26 1.14±0.19 1.06±0.32 1.35±0.58 1.30±0.56 2.98±1.0 2.89±0.5 3.20±0.6 9.01±0.98 7.11±1.74◆▲4.46±1.24◆▲★1.01±0.26 0.93±0.17 0.38±0.11◆▲★1.23±0.48 1.57±0.54 1.96±0.60◆▲3.02±0.5 3.24±0.8 5.35±1.37◆▲9 7363★

表2 各組大鼠左側(cè)睪丸組織AR、FSHR、LHR平均灰度值（ ±s）Tab.2 The average gray value of AR,FSHR,LHR of the left testis in rats of all groups( ±s)

表2 各組大鼠左側(cè)睪丸組織AR、FSHR、LHR平均灰度值（ ±s）Tab.2 The average gray value of AR,FSHR,LHR of the left testis in rats of all groups( ±s)

注：◆相同時(shí)間段內(nèi)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有差異（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M內(nèi)不同時(shí)間段比較，▲與2周組比較有差異（P＜0.05）；★與4周組比較有差異（P＜0.05）Note：◆ there were significant differences between experiment group and control group (P＜0.05);▲ there were significant differences compared with the 2-weeks group in experiment group or control group (P＜0.05),★ there were significant differences compared with the 4-weeks group (P＜0.05)in experiment group or control group

分組 只數(shù) 雄激素受體 卵泡刺激素受體 黃體生成素受體對(duì)照組2周組4周組8周組實(shí)驗(yàn)組2周組4周組8周組666 666 144.29±7.85 144.41±5.46 141.78±6.85 128.57±8.00 120.49±4.04 126.89±8.28 156.89±8.22 155.64±11.80 155.45±10.34 136.61±3.65 154.98±8.58▲160.07±5.29◆▲122.47±4.34 125.02±6.54 141.28±5.73◆▲★138.77±7.41◆★158.45±6.46 171.31±8.29◆▲★

表3 各組大鼠左側(cè)睪丸組織凋亡率（ ±s）Tab.3 The apoptosis rate of the left testis in rats of all groups( ±s)

表3 各組大鼠左側(cè)睪丸組織凋亡率（ ±s）Tab.3 The apoptosis rate of the left testis in rats of all groups( ±s)

注：◆相同時(shí)間段內(nèi)實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組相比有差異（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M內(nèi)不同時(shí)間段比較，▲與2周組比較有差異（P＜0.05）；★與4周組比較有差異（P＜0.05）Note：◆ there were significant differences between experiment group and control group (P＜0.05)； ▲ there were significant differences compared with the 2-weeks group in experiment group or control group (P＜0.05),★ there were significant differences compared with the 4-weeks group (P＜0.05)in experiment group or control group

分組 只數(shù) 凋亡率（%）對(duì)照組2周組4周組8周組實(shí)驗(yàn)組2周組4周組8周組666 666 5.97±0.90 5.35±1.05 6.28±0.89 8.74±1.79◆★19.08±2.31◆▲30.61±1.77◆▲★

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠造模成功后2周時(shí)睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡顯著增加，隨時(shí)間進(jìn)展而進(jìn)一步增加；實(shí)驗(yàn)組大鼠生精細(xì)胞于造模成功4周時(shí)凋亡顯著增加，8周時(shí)凋亡進(jìn)一步加重。造模成功4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組ITC開始下降，且隨時(shí)間進(jìn)展而進(jìn)一步下降，這個(gè)結(jié)果與劉建軍等[8]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。4周時(shí)血清T濃度與對(duì)照組并無(wú)明顯差異，可能是由于除睪丸組織外，腎上腺等分泌的T代償性增加，維持血清T在正常濃度。血清T濃度于8周時(shí)開始下降，這與AndóS等[9]的研究結(jié)果一致，但Canales等[10]研究卻發(fā)現(xiàn)VC并不明顯降低患者外周血T濃度，這可能與外周血血清T濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于ITC，而不同程度的靜脈曲張對(duì)間質(zhì)細(xì)胞影響不同所致，本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組大鼠外周血T下降可能與ITC較4周時(shí)進(jìn)一步下降而睪丸組織外睪酮分泌不足以代償有關(guān)。血清FSH、LH濃度于造模成功8周后顯著上升，這可能是由于血清T濃度下降使其對(duì)垂體抑制作用降低導(dǎo)致的。AR于造模4周后表達(dá)下降，這與ITC的下降是同步的，內(nèi)源性T可控制睪丸內(nèi)AR的表達(dá)，這可能與雄激素能降低AR的降解速率以及控制AR蛋白的生物合成有關(guān)[11]。FSHR在造模8周時(shí)表達(dá)顯著降低，可能是由于血清FSH濃度升高，抑制了FSHR的表達(dá)。LHR在造模2周時(shí)表達(dá)顯著升高，這可能是間質(zhì)細(xì)胞凋亡減少后通過某種代償機(jī)制使LHR表達(dá)升高，維持LH對(duì)間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的促進(jìn)作用，使睪酮保持較高濃度，從而維持睪丸的生精作用；到4周時(shí)則與對(duì)照組比較無(wú)差異，LH對(duì)ITC分泌的刺激作用較2周時(shí)下降，這可能是由于睪丸間質(zhì)細(xì)胞功能障礙致使LHR表達(dá)降低；到造模后8周時(shí)，LHR較對(duì)照組表達(dá)顯著降低，可能是由于較高的血清LH以及間質(zhì)細(xì)胞功能障礙等因素抑制了LHR的表達(dá)。

由于T和FSH都是通過各自的受體發(fā)揮生理功能，因此，AR和FSHR的變化反映了這兩種激素在精子發(fā)生過程中的有序表達(dá)和整體功能，它們?cè)赥和FSH的作用下，共同調(diào)節(jié)精子發(fā)生過程中的程序性基因表達(dá)[12]。缺少其中的任何一種激素都會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生的障礙：缺乏T，則不能完成精子細(xì)胞的變態(tài)，而缺乏FSH，則會(huì)導(dǎo)致粗線期精母細(xì)胞的程序性死亡[13]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)精索靜脈曲張可致大鼠ITC、血清T下降，并使AR表達(dá)下降，而睪丸的生精過程需要睪丸組織高濃度的ITC。在精索靜脈曲張進(jìn)展初期，間質(zhì)細(xì)胞就已經(jīng)開始受損，且早于生精細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞可能通過上調(diào)LHR水平，來代償性增加睪酮分泌，使睪酮維持在正常水平，隨著間質(zhì)細(xì)胞凋亡增加，ITC逐漸失代償，而睪丸生精細(xì)胞凋亡增加與ITC下降同步，這與生精細(xì)胞成熟需要睪丸內(nèi)較高濃度睪酮的結(jié)論是相符合的。垂體分泌FSH、LH受血清T濃度的影響，二者受體表達(dá)與其血清水平呈反比，在VC進(jìn)展后期雖然二者血清濃度上升，可由于睪丸間質(zhì)細(xì)胞過度凋亡，ITC顯著下降，即使FSH及LH維持正常甚至較高的功能，生精過程也無(wú)法正常完成。

隨著VC的進(jìn)展，EV大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞及生精細(xì)胞的損傷和凋亡會(huì)逐漸增加，導(dǎo)致ITC及血清T濃度下降，并使睪丸AR表達(dá)降低；FSH、LH濃度會(huì)隨著血清T下降而上升，二者睪丸受體表達(dá)隨之出現(xiàn)降低。總之，VC通過影響ITC和血清T、FSH、LH濃度及其睪丸受體的表達(dá)，進(jìn)而影響生精細(xì)胞發(fā)生、增殖和分化等一系列的生理過程，甚至引起不育。

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