HPLC同時(shí)測定沒食子中沒食子酸與沒食子酸甲酯的含量

秦冬梅， 胡利萍， 張躍新

(1石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子832002;2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，新疆烏魯木齊830054)

沒食子(Turkish galls)為殼斗科植物沒食子樹Quercus infectoria Oliv幼枝上的干燥蟲癭，由沒食子蜂科昆蟲沒食子蜂Cynips gallae-tinctoriae Oliv.幼蟲寄生而形成。沒食子是維吾爾醫(yī)常用藥，沒食子中含有大量的可水解鞣質(zhì)，具有固澀、收斂、燥濕、止血、消炎的作用［1］。沒食子鞣質(zhì)多數(shù)為無定形粉末，并且具有較多的鄰位酚羥基，易被氧化，因此，很難獲得單體。從沒食子鞣質(zhì)中分離得到了單體鞣質(zhì)沒食子酸與沒食子酸甲酯，故制訂了高效液相法同時(shí)測定沒食子酸與食子酸甲酯的含量，以控制藥品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試藥

Waters液相色譜儀;DK-S26型電熱恒溫［水浴鍋(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);單盤光電分析天平(北京光學(xué)儀器廠，d:0.01 mg);實(shí)驗(yàn)用植物購于新疆參茸藥業(yè)有限公司，品種鑒定由新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院中藥系完成，沒食子酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:831-9501);沒食子酸甲酯對照品(自制)，經(jīng)鑒定純度達(dá)99.42%，其 H-NMR、13C-NMR、UV、IR和ESI-MS數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［2］對照一致。甲醇為色譜純，水為重蒸水，磷酸(分析純)，甲醇(分析純)。

1.2 色譜條件［3］色譜柱:

YMC ODS-A C18柱(250 mm ×4.6 mm，S-5 μm，12 nm);檢測波長:273 nm;流動相:乙腈-0.5%磷酸溶液(21∶79);流速:0.50 mL/min;柱溫:25℃。理論板數(shù)按沒食子酸甲酯峰計(jì)算為2 100，外標(biāo)法。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的配制 精密稱取沒食子酸對照品適量，用甲醇定容制成含沒食子酸0.050 mg/mL，精密稱取沒食子酸甲酯對照品適量，用甲醇定容制成含沒食子酸甲酯0.130 0 mg/mL的溶液。

2.1.2 供試品溶液的配制［4］取本品研細(xì)，精密稱取適量(約1 g)，置于棕色具塞錐形瓶中，加甲醇25 mL，密塞，超聲提取30 min，放冷致室溫，過微孔濾膜(0.45 μm)，即得。

2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別取對照品溶液、樣品溶液注入色譜儀，按1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，1號峰為沒食子酸，2號峰為沒食子酸甲酯，結(jié)果見圖1。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取濃度為0.050 0 mg/mL沒食子酸與0.130 0 mg/mL的沒食子酸甲酯對照品溶液，進(jìn)樣量分別為0.5、2、5、8、10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣，以峰面積積分值(A)對進(jìn)樣量(μg)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，沒食子酸與沒食子酸甲酯分別得回歸方程y=3 697 526x-9 965 r=0.999 6;y=4 434 792x-14 628 r=0.999 2，沒食子酸在0.050 6～0.406 0 μg范圍內(nèi)峰面積值(y)對進(jìn)樣量(x)有良好線性關(guān)系，沒食子酸甲酯在0.116～1.044 μg范圍內(nèi)，峰面積值(y)對進(jìn)樣量(x)有良好線性關(guān)系。

圖1 對照品(A)、供試品(B)色譜圖

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述沒食子酸與沒食子酸甲酯對照品溶液10 μL，在上述色譜條件下，按1.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算含量的RSD分別為0.84%，1.05%;供試液分別連續(xù)5d測定沒食子酸與沒食子酸甲酯含量，計(jì)算含量的RSD分為0.95%，1.08%。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一樣品溶液10 μL，分別在 0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣，試驗(yàn)結(jié)果表明樣品溶液在 10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，沒食子酸與沒食子酸甲酯的 RSD分別為1.09%，1.62%。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 對同一批樣品，6份，按2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測峰面積，并計(jì)算沒食子酸與沒食子酸甲酯含量。沒食子酸平均含量為9.52 mg/mL，RSD為0.96%，沒食子酸甲酯平均含量為2.76 mg/mL，RSD為0.71%。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)采用加樣回收法。分別稱取已知含量的供試品9份，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法精密加入對照品溶液，制備高、中、低3個(gè)濃度的溶液，依條件進(jìn)行測定，計(jì)算各組分的回收率。沒食子酸的平均回收率為98.8%，RSD為1.50%，沒食子酸甲酯的平均回收率為98.50%，RSD為1.26%。見表1。

2.4 樣品含量測定

按2.1.2項(xiàng)下處理方法配置，依上述方法分別精密吸取供試品溶液與對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中沒食子酸與沒食子酸甲酯含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 以流動相作溶劑，在200～400 nm波長范圍內(nèi)測定了沒食子酸紫外光譜圖，結(jié)果在273 nm處有最大吸收，確定273 nm為測定波長。

3.2 溶劑的選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了沒食子酸在甲醇與水中的穩(wěn)定性［5-7］，結(jié)果沒食子酸甲酯在甲醇中8h內(nèi)穩(wěn)定，在水中不穩(wěn)定，故選用甲醇為溶劑。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 沒食子酸與沒食子酸甲酯含量測定結(jié)果(n=3)

3.3 提取方式以及提取時(shí)間的選擇 實(shí)驗(yàn)中考察了不同提取方式(加熱回流和超聲提取)、不同提取時(shí)間(30、45、60 min)。結(jié)果表明，精密加入甲醇25 mL超聲處理30 min，可將樣品中的沒食子酸提取完全［8-10］。

3.4 建立了測定沒食子中沒食子酸與沒食子酸甲酯的高效液相色譜法，該方法可作為測定藥材和制劑中沒食子酸與沒食子酸甲酯含量的方法［9-10］，可作為其質(zhì)量控制指標(biāo)之一。

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