蒲公英中有機酸類成分的提取工藝研究

李喜鳳， 郝 哲， 邱天寶， 許 閩， 余云輝， 杜云鋒

(1.河南中醫(yī)學院，河南鄭州450008;2.中國人民解放軍第一五三中心醫(yī)院藥械科，河南鄭州450042)

蒲公英 Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.為臨床常用中藥，有清熱解毒，消腫散結，利尿通淋之功效。蒲公英含有多種活性成分，如黃酮類，皂苷類，有機酸類，多糖等。其中咖啡酸和綠原酸具有明顯的抑菌作用，阿魏酸具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化等藥理作用［1］。目前對于蒲公英藥材及其制劑提取工藝的研究較少［2-7］，本實驗采用正交設計試驗法以咖啡酸、綠原酸、阿魏酸的含量為考察指標，用高效毛細管電泳法［8-14］進行測定，篩選出了蒲公英中3種有機酸成分的最佳提取工藝。

1 儀器和試劑

1.1 儀器 美國Beckman公司P/ACETMMDQ毛細管電泳儀，DAD檢測器 ，Karat 32系統(tǒng)軟件，未涂層石英毛細管柱(75 μm ID×50/57 cm，分離長度/總長，河北永年銳灃色譜器件有限公司)，PHS-2SB型數(shù)字酸度計(上海大譜儀器有限公司)，YUEPINGFA2004b型電子天平(上海越平科學儀器有限公司)。

1.2 試藥 蒲公英藥材采于河南省不同地區(qū)，經(jīng)河南中醫(yī)學院生藥學科陳隨清教授鑒定均為菊科植物蒲公英T.mongolicum Hand-Mazz的干燥全草?？Х人釋φ掌?批號:110885-200102)，綠原酸對照品(批號:110753-200413)，阿魏酸對照品(批號:0773-9809)均由中國藥品生物制品檢定所提供。水為娃哈哈純凈水，所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 電泳條件 電壓18 KV;壓力進樣0.5 psi;進樣時間5 s;檢測波長325 nm;溫度25℃;硼砂濃度20 mmol/L(1 mol/L NaOH調(diào)pH 9.55)。

2.2 毛細管預處理 實驗前依次用NaOH(0.1 mol/L)溶液、水、緩沖液依次沖洗10、10、20 min，進樣前分別用NaOH(0.1 mol/L)溶液、水、緩沖液依次沖洗3、2、3 min。實驗結束后用 NaOH(0.1 mol/L)溶液、水沖洗10 min。所用溶液進樣前均用0.45 μm的濾膜過濾，并超聲脫氣3 min。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取咖啡酸、綠原酸、阿魏酸對照品適量加70%甲醇溶解并制成濃度為0.097 6、0.084 8、0.005 4 mg/mL 的溶液，搖勻，作為對照品貯備液，見圖1。

2.4 供試品溶液的制備 取蒲公英細粉1 g，精密稱定，按L9(34)工作表制備樣品溶液，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15 mL使溶解，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖萃取4次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣用70%甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻，即得，見圖2。

圖2 供試品HPCE圖

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 精密量取咖啡酸、綠原酸、阿魏酸混合對照品溶液 1、2、4、6、8 mL分別置 10 mL量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，搖勻。按2.1項下條件進樣，測定各組分的峰面積，以濃度X(mg/mL)為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標計算回歸方程:咖啡酸的回歸方程為Y=1×106X-1 115，r=0.999 8，線性范圍為:0.009 76～0.078 08 mg/mL;綠原酸的回歸方程為Y=48 894X-1 387.3，r=0.999 8，線性范圍為:0.008 48～0.067 84 mg/mL;阿魏酸的回歸方程為Y=791 926X-78.689，r=0.999 9，線性范圍為:0.000 54～0.004 32 mg/mL。

2.5.2 精密度試驗 精密吸取同一咖啡酸、綠原酸、阿魏酸混合對照品溶液，在上述分離條件下重復進樣5次，其峰面積的RSD分別為1.8%、1.9%、1.6%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗 取同一批蒲公英樣品5份，按下述正交試驗最佳提取工藝制備供試品溶液，測得咖啡酸峰面積的RSD為1.7%，綠原酸峰面積的RSD為1.23%，阿魏酸峰面積的RSD為1.9%。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取上述樣品溶液，每隔2 h進樣，連續(xù)10 h，結果咖啡酸峰面積的 RSD為1.7%，綠原酸的峰面積的RSD為1.7%，阿魏酸峰面積的RSD為1.8%。表明咖啡酸、綠原酸、阿魏酸在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知咖啡酸、綠原酸、阿魏酸含量的蒲公英樣品9份，分別按80%、100%、120%三個濃度精密加入對照品溶液適量，制備供試品溶液，結果顯示咖啡酸、綠原酸、阿魏酸的平均回收率為97.71%、97.96%、98.24%;RSD值為1.05%、1.44%、0.96%。

2.6 單因素提取工藝篩選試驗及結果

2.6.1 乙醇濃度的影響 準確稱量蒲公英粗粉1 g共6份，3組，每組實驗重復2次，分別加60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇20 mL水浴回流1.5 h，按2.1項下電泳條件進樣，分別測定咖啡酸、綠原酸及阿魏酸的含量，結果顯示80%乙醇提取效果較好，見圖3。

2.6.2 回流時間的影響 準確稱量蒲公英粗粉1 g共6份，3組，每組實驗重復2次，分別加80%乙醇20 mL 水浴回流0.5、1、1.5、2、2.5 h，分別測定咖啡酸、綠原酸及阿魏酸的含量，結果顯示回流2 h效果最佳，見圖4。

圖3 乙醇濃度的影響

圖4 回流時間的影響

2.6.3 溶劑量的影響 準確稱量蒲公英粗粉1 g共6份，3組，每組實驗重復2次，分別加80%乙醇10、20、30、40、50 mL，水浴回流 2 h，分別測定咖啡酸、綠原酸及阿魏酸及的含量，結果顯示溶劑量為40 mL提取效果較好，見圖5。

2.6.4 提取次數(shù)的影響 準確稱量蒲公英粗粉1 g共6份，3組，每組實驗重復2次，分別加80%乙醇20 mL水浴回流，3組分別提取1次、2次、3次，每次2 h，分別測定咖啡酸、綠原酸及阿魏酸的含量，結果差別不大，故選擇提取1次為宜。

圖5 料液比的影響

2.6.5 不同藥材粒度的影響 準確稱量不同粒度的蒲公英粉末(粗粉、50目、65目、120目)1 g共8份，4組，每組實驗重復2次，分別加80%乙醇20 mL水浴回流2 h，分別測定咖啡酸、綠原酸、阿魏酸的含量，結果顯示藥材粒度為50目較好，但相差不大，故不做為正交因素考察。

2.7 正交試驗設計及結果 通過上述單因素試驗確定3因素3水平作為正交試驗的因素和水平，進一步確定最佳提取工藝。因素水平表見表1，L9(34)正交實驗安排及結果，見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗

由直觀分析可知，影響提取效果的因素為:A(乙醇濃度)＞B(溶劑量)＞C(提取時間)，以乙醇濃度影響最大，溶劑量次之，提取時間影響最小。經(jīng)方差分析可知:乙醇濃度對提取效果影響最顯著，溶劑量對提取效果影響顯著，提取時間對提取效果無顯著性差異，為節(jié)約生產(chǎn)成本，確定最佳提取條件為A2B3C1。

2.8 驗證試驗 為進一步考察上述工藝的穩(wěn)定可行性，精密稱定蒲公英藥材1 g，按優(yōu)選工藝A2B3C1重復試驗3次，結果見表4。

表3 方差分析表

表4 驗證試驗結果

結果表明，按優(yōu)選的最佳提取工藝提取，有效成分提取效果好，表明該工藝合理穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 正交試驗結果表明，蒲公英中有機酸的最佳提取條件為:80%乙醇，料液比為1∶40，水浴回流1.5 h，各有機酸的提取率均較高。

3.2 以多種有效成分為指標評價成分復雜的中藥材，具有一定的科學合理性，本實驗以蒲公英的主要有效成分咖啡酸、綠原酸、阿魏酸的含量為指標研究最佳提取工藝，同時根據(jù)各成分在藥效中所起的作用賦予不同的權重系數(shù)綜合評分進行評價，避免了對多指標單獨評價時相互間的沖突。

［1］趙東平，楊文鈺，陳興福.阿魏酸的研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥 2008，19(8):1839-1841.

［2］譚紅勝，夏新華，楚生輝.正交試驗法優(yōu)選蒲公英水提工藝［J］.中藥材，2004，27(3):211-212.

［3］沈 奇，趙厚民，張衛(wèi)明，等.蒲公英綠原酸提取分離工藝的研究［J］.食品科學，2006，27(7):140-143.

［4］張西如，姜建國.正交試驗研究蒲公英注射液的提取工藝［J］.中成藥，2007，29(7):1075-1077.

［5］尹 青，張 華.超聲波法提取蒲公英中的綠原酸［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30(5):23-27.

［6］李喜鳳，郝 哲，杜云峰.蒲公英中總黃酮提取工藝的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(7):1695-1696.

［7］鐘振聲，趙蓓蓓，孫 昂.蒲公英抑菌物質(zhì)的提取工藝研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25(1):58-61.

［8］盧 玲，楊 翰，周 濤.高效毛細管電泳法測定仲草膠囊中槲皮素與綠原酸的含量［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2010，19(13):1637-1681.

［9］李利軍，馮 軍，陳其峰，等.毛細管電泳同時分離測定阿魏酸、異阿魏酸的研究［J］.分析試驗室，2008，27(9):46-49.

［10］盛 強，何業(yè)偉，施 敏.HPCE法測綠梅止瀉顆粒中綠原酸的含量［J］.中國醫(yī)藥指南，2009，7(17):77-78.

［11］韋壽蓮，劉君紅，郭海福，等.毛細管電泳對葉下珠中有機酸的分離檢測［J］.分析測試學報，2009，28(6):692-696.

［12］石 雪，張海濤，邢曉平，等.毛細管電泳-電化學檢測法分析竹葉及竹葉茶中的活性成分［J］.分析科學學報，2009，25(2):143-147.

［13］靳淑萍，李 萍，董樹清，等.毛細管電泳-電化學檢測法測定黃芪及其制劑中的活性成分［J］.色譜，2009，27(2):229-232.

［14］郭興輝，劉 偉.HPCE法測定夏枯草中咖啡酸的含量［J］.中國藥事，2010，24(2):166-167.