創(chuàng)面修復中骨橋蛋白和表皮生長因子受體表達變化的實驗研究

隋志甫 ，劉靜杰 ，谷廷敏 ，李 蠡 ，趙志力 ，閻曉輝

1.解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院美容整形中心，北京 100125；2.海軍總醫(yī)院整形外科，北京 100048

隨著細胞生物學、分子生物學和生物化學的深入發(fā)展，人們對創(chuàng)傷修復的認識不斷豐富和深化。OPN是一種磷酸化糖蛋白，作為一種炎癥因子，參與了多種組織的病理性纖維化過程，最近的研究發(fā)現(xiàn)抑制ICR小鼠OPN的表達可加速其皮膚創(chuàng)口愈合，并減少肉芽組織及瘢痕的形成[1-2]。EGFr作為表皮生長因子的受體具有促進表皮細胞增殖和爬行、促進成纖維細胞增殖和增加膠元合成等獨特的生物學作用[3]。既往動物試驗提示OPN和EGFr與創(chuàng)面愈合過程明顯相關，為了解其相關性的普遍意義，筆者采用免疫組化與原位雜交學方法觀察燒傷患者創(chuàng)面中OPN和EGFr的表達變化，分析并探討OPN和EGFr在臨床創(chuàng)面修復過程中的作用。

1 資科與方法

1.1 標本來源及制備

自2008年6月～2010年6月選取大面積燒傷患者，平均燒傷面積為（32.5±4.2）%TBSA，創(chuàng)面中的淺Ⅱ度創(chuàng)面，共15例，男10例，女5例；年齡19～43歲，創(chuàng)面位于下腹部和大腿，經(jīng)組織學證實均為淺Ⅱ度創(chuàng)面，患者無特殊疾患。每一病例經(jīng)知情同意后， 分別于傷后 1、3、5、7、9、11 d 時于局麻下用眼科角膜環(huán)鉆切取包括創(chuàng)面、創(chuàng)基及少量皮下脂肪在內的標本，選取植皮手術時取皮區(qū)的正常皮膚作為對照，分別置于10%中性福爾馬林和4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成5 μm的組織切片備用。

1.2 OPN和EGFr檢測

①OPN檢測：切片二甲苯脫蠟2次，每次10 min；梯度乙醇水化，0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次5 min；3%過氧化氫室溫孵育30 min，0.01 mol/L PBS浸洗；0.1%胃蛋白酶37℃孵育10 min，0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次5 min；滴加5%BSA，37℃封閉30 min，吸去多余液體。鼠抗人OPN單克隆抗體（1∶100）（美國SANTA CRUZ公司）37℃孵育1 d，經(jīng)0.01 mol/L PBS浸洗后滴加生物素化羊抗鼠IgG（美國SANTA CRUZ公司），37℃孵育30 min后，0.01 mol/L PBS清洗，滴加SABC，37℃下孵育30 min，再次經(jīng)0.01 mol/L PBS清洗，以二氨基聯(lián)苯氨（DAB）顯色，鏡下控制反應時間，蘇木精輕度復染，常規(guī)脫水、透明、封片，同時設無一抗的空白對照。顯微鏡下觀察，陽性顆粒為棕色。②EGFr檢測：用地高辛標記EGFr的cDNA探針后進行組織切片的原位雜交，組織切片脫蠟入水，0.2 mol/L鹽酸酸化，蛋白酶K消化，酒精脫水，置預雜交液（42℃）預雜交4 h，入雜交液雜交（42℃）17 h后用Boegringer Mannheim公司產(chǎn)品Dig-DNA labelling and detection試劑盒觀察切片中EGFr活化表達的mRNA的變化情況。顯微鏡下觀察，陽性顆粒為棕黃色。400倍光鏡下測定其相對含量，每組選擇5張切片，每張切片連續(xù)記數(shù)5個視野，求出每個視野內陽性顆粒平均數(shù)。 陰性（-）：視野內無陽性信號；弱陽性（+）：視野內可見10個以下陽性信號；中等陽性（++）：視野內可見11～30個陽性信號；強陽性（+++）：視野內可見大于30個陽性信號。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理組間變化，進行方差分析，組間行Student's t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

實驗結果顯示，燒傷能誘導創(chuàng)面組織OPN和EGFr的表達，但二者表達不盡相同。在正常皮膚中，OPN陽性顆粒細胞分布于毛囊、汗腺及皮脂腺，在表皮及真皮部分均無分布，表達強度（-）。燒傷后第1天起OPN陽性顆粒廣泛分布于真皮層成纖維細胞的胞漿中及毛囊、汗腺及皮脂腺周圍，但呈松散稀疏分布；在第3天時這種分布最為密集，OPN表達強度最高（+++），隨后的5～7 d其表達強度逐步減弱。正常皮膚內EGFr僅有弱陽性表達（+），燒傷后第1天起EGFr的表達逐漸增加，在傷后7 d時達峰值，呈強陽性表達（+++），此后逐漸下降，其陽性顆粒主要分布于表皮基底細胞胞漿、真皮成纖維細胞的胞核內及毛囊、汗腺及皮脂腺周圍。傷前OPN和EGFr陽性顆粒表達數(shù)量與傷后表達高峰期自身對比差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1、圖1。

表1 創(chuàng)面修復過程中骨橋蛋白和表皮生長因子受體表達強度

3 討論

皮膚創(chuàng)傷愈合的基本過程可以分為三個連續(xù)或者重疊的時期：炎癥期、細胞外基質沉積期及組織改建期。這一過程有多種細胞因子、各類型的細胞和細胞外基質共同參與[4-5]。這些細胞因子如果調控失常會干擾正常的組織修復過程而出現(xiàn)愈合過慢形成潰瘍或者愈合過度形成瘢痕[6]。骨橋蛋白是一種磷酸化糖蛋白，在1985年，F(xiàn)ranzen等[7]在大鼠礦化的骨基質中分離出一種含“精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸”序列（RGDsequence）的磷酸化糖蛋白，命名為骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）。隨后的研究發(fā)現(xiàn)OPN廣泛存在于多種組織中，包括腎、膽囊、肺部、乳房、腸胃以及尿道[8-9]。此外，OPN作為一種炎癥因子，參與各種組織的病理性纖維化過程，在多種腫瘤組織內也發(fā)現(xiàn)OPN的表達[10-11]。在皮膚創(chuàng)口愈合方面，最近的研究發(fā)現(xiàn)抑制ICR小鼠OPN的表達可加速其皮膚創(chuàng)口愈合，并減少肉芽組織及瘢痕的形成，但其內在機制有待進一步研究。本實驗顯示，在正常皮膚的表皮及真皮部分均未檢測到OPN陽性顆粒，在毛囊、汗腺及皮脂腺周圍可見散在分布。燒傷后第1天起OPN陽性顆粒廣泛分布于真皮層成纖維細胞的胞漿及毛囊、汗腺、皮脂腺周圍，但呈松散稀疏分布；在第3天時這種分布最為密集，OPN表達強度最高，隨后的5～7 d其表達強度逐步減弱。可以看出OPN表達的高峰期與細胞外基質沉積的高峰期一致，推測OPN可能參與了創(chuàng)面修復初期的細胞外基質的沉積，從而影響創(chuàng)面愈合。表皮生長因子（EGF）、EGFr蛋白在調控組織細胞的增殖方面有很重要的作用，各種刺激引起EGF、EGFr蛋白表達后，組織中相應的細胞因子增多，從而促進細胞分裂增殖和創(chuàng)傷的愈合[12]。EGFr是多細胞生物中介導EGF發(fā)揮其生物學效應的關鍵成分，EGF只有與其靶細胞膜表面的EGFr結合才能發(fā)揮其生物學作用。本研究結果表明：正常皮膚內EGFr僅有弱陽性表達，燒傷后第1天起EGFr的表達逐漸增加，陽性顆粒多數(shù)分布在創(chuàng)緣上皮、創(chuàng)面表面的細胞、真皮淺層成纖維細胞、皮脂腺、汗腺、毛囊周圍，傷后7～9 d EGFr表達量最多，表達最強，傷后3～5 d次之，傷后11 d進一步減少。這可能是傷后早期創(chuàng)面組織細胞對創(chuàng)傷刺激尚無明顯反應，EGFr合成較少；傷后7～9 d時組織細胞對創(chuàng)傷刺激反應明顯增強，EGFr合成增多；傷后11 d以后，創(chuàng)面縮小，組織細胞自我調節(jié)，降低了反應性，因此EGFr蛋白合成下降，這與機體為避免組織過度增生所產(chǎn)生的“接觸性抑制”相一致[13]。

創(chuàng)面修復是一個多種因素參與的復雜生物過程，本研究顯示：在整個臨床創(chuàng)面修復過程中，特別是創(chuàng)面修復的初、中期，OPN和EGFr均有明顯的表達，且分布范圍多數(shù)在創(chuàng)面修復細胞增殖的活躍部位（表皮或真皮層成纖維細胞的胞漿或胞核、毛囊、汗腺、皮脂腺等），這與以往動物實驗的結果相似，這種表達的時相性和區(qū)域性分布特點表明OPN和EGFr參與了臨床創(chuàng)面修復的各時期（特別是初、中期）的細胞代謝和增殖。提示我們如果在臨床創(chuàng)面修復的不同時期采取措施，合理調控OPN和EGFr的表達，將有助于加快創(chuàng)面愈合，減少瘢痕形成。

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