銀杏葉提取物的HPLC/UV指紋圖譜研究

帥英麗，于紅艷，李志強

天津生物化學制藥有限公司，天津 300308

銀杏葉提取物是從我國特有的銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉中得到的提取物，具有斂肺、活血化瘀等功效，20世紀60年代以來，國內(nèi)外學者對銀杏葉的化學成分、藥理及臨床做了大量的工作，現(xiàn)國內(nèi)外已有多種制劑上市。其主要含有黃酮類、萜類內(nèi)酯類和酚酸類化合物，《中國藥典》2005年版（一部）對銀杏葉提取物中黃酮及萜類內(nèi)酯類的含量均有規(guī)定，但是因為中藥成分的復雜性，往往控制這兩種成分還不能真實反映其質(zhì)量，而色譜指紋圖譜分析可以使中藥所含多種化學成分的整體可視化，為更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量提供了可行性。為了更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量，采用高效液相色譜法對本品指紋圖譜進行了研究，得到了分離度、重現(xiàn)性均較好的銀杏葉提取物特征指紋圖譜，為其質(zhì)量控制提供了依據(jù)，也為銀杏葉提取物以及銀杏葉的指紋圖譜國家標準的確立提供了更為科學的依據(jù)和有效的鑒別方法[1]。

1 儀器和試藥

Shimadzu LC-10AT VP雙泵高效液相色譜儀，Shimadzu SPD-10A VP紫外檢測器，Classvp色譜工作站。乙腈、異丙醇為色譜純，磷酸、磷酸二氫鉀、檸檬酸均為分析純，蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200707），銀杏葉對照提取物 （中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200609），銀杏葉提取物 （北京康立生醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司， 批號：00601、00602、00603、00701、00702、00703、00801、00802、00803、00901）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 參照物溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品適量，加50%甲醇制成每1 ml含0.03 mg的溶液，即得。

2.1.2 對照提取物的制備 精密稱取銀杏葉對照提取物0.087 5 g，置于25 ml量瓶中，水浴加熱使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取銀杏葉提取物0.087 5 g，置于25 ml量瓶中，水浴加熱使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。

2.1.4 測定法 分別精密吸取參照物溶液、對照提取物溶液與供試品溶液各10 ml，注入液相色譜儀，測定，記錄0～100 min的色譜峰，即得。

2.2 色譜條件

Diamonsil（C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；檢測波長：360 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：25℃；流動相（A）：水-乙腈-異丙醇-檸檬酸（1 000∶470∶50∶6.08）；流動相（B）：水-乙腈-異丙醇-檸檬酸（1 400∶200∶30∶6.88）；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

2.3 方法學考察

2.3.1 檢測波長的選擇 取蘆丁對照品溶液，在200～400 nm波長范圍進行掃描，結(jié)果在255 nm和360 nm波長處有最大吸收；另取槲皮素、山奈素、異鼠李素的線性范圍分別為0.050～0.400 μg、0.005～0.040 μg、0.005～0.040 μg，在 200～400 nm波長范圍對槲皮素、山奈素、異鼠李素對照品溶液進行掃描，結(jié)果分別在368 nm、366 nm、370 nm波長處有最大吸收，考慮到指紋圖譜檢測的色譜峰主要是黃酮醇苷，所以選擇360 nm作為檢測波長。

2.3.2 參照物確定試驗 銀杏葉提取物中蘆丁的含量較大，在此色譜條件下所獲得的色譜相應(yīng)值較高，所以選擇蘆丁作為參照物，照“2.1”項下的要求制備參照物溶液，進樣 10 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，其主峰的保留時間用于確定銀杏葉提取物中蘆丁峰的峰位[2]。

2.3.3 精密度試驗 取同一份供試品溶液，連續(xù)進樣6次，各主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積比值的RSD分別為2.68%和2.44%，均＜3%，表明精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批銀杏葉提取物，照“2.3”項下的要求制備供試品溶液，進樣 10 μl，分別在 0、2、6、12、24 h 不同時間點進樣，各主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積比值的RSD分別為2.48%和2.88%，均小于3%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復性試驗 取同一批銀杏葉提取物6份，按供試品溶液的制備和檢測方法分別進行檢測，各主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積比值的RSD分別為2.89%和2.15%，均小于3%。表明本方法的重復性良好。

2.3.6 樣品測定及結(jié)果 13個共有峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均＜3.0%，經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件計算，除有個別峰有一定的差別，10批樣品相互之間相似度均＞0.90。說明樣品間質(zhì)量重復性較好，符合測試要求。見表1、2及圖1。

表1 不同批次銀杏葉提取物指紋圖譜的測定結(jié)果（相對保留時間）

表2 不同批次銀杏葉提取物指紋圖譜的測定結(jié)果（相對峰面積）

3 討論

3.1 流動相的選擇

銀杏葉提取物中所含成分極性跨度很大，其含量最多的黃酮類成分含有多個酚羥基[3]，呈弱酸性，故使用酸性緩沖體系，分別選用了醋酸體系和檸檬酸體系，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用檸檬酸體系可以得到更好的分離條件及峰形，又比較了甲醇-檸檬酸與乙腈-檸檬酸體系，發(fā)現(xiàn)乙腈-檸檬酸體系更好，同時發(fā)現(xiàn)流動相中加入適量的異丙醇可以使峰形對稱度更好。

3.2 色譜柱的選擇

由于銀杏葉提取物中所含的成分主要為黃酮醇苷類[4]，故選擇了C18反相柱，實驗中分別使用了四種不同廠家的C18反相柱。 ①Kromasil（C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）；②Agilent（C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）； ③Diamonsil （C18，250 mm×4.6mm，5μm）。 結(jié)果表明實驗所用的 Diamonsil（C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）分離較果最佳，重現(xiàn)性好。

3.3 樣品測定

測定本品10批樣品，本品指紋圖譜中出現(xiàn)13個共有峰，以對照提取物為對照，經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件計算，10批樣品與對照提取物相似度均＞0.90，故規(guī)定本品與對照提取物，經(jīng)中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件計算，相似度不得＜0.90。

[1]王京輝,杜小偉,王萌萌,等.舒血寧注射液、銀杏葉提取物及銀杏葉指紋圖譜研究[J].藥物分析雜志,2008,28(7)：1026-1030.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)[S].2003.

[3]Teris A van Beek Analysis and Quality control of Ginkgo biloba Leaves and Standardised Extracts[J].Proceedings of 97 International Seminar on Ginkgo,1997：158.

[4]葉秀波,岑幗英,李瑞明.HPLC法測定銀杏葉軟膠囊中總黃酮的含量[J].中國醫(yī)藥導報,2010,7(33)：29-30.