B7-H4在大鼠創(chuàng)傷性關節(jié)炎模型關節(jié)腔中的表達情況

茍亞軍，蒲友敏，郭國寧

第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院急救部，重慶 400038

創(chuàng)傷性骨關節(jié)炎（Post-tramatic Ostocarthritis）是骨關節(jié)炎的常見類型之一[1]。近年來，隨著外傷、交通事故的增多，創(chuàng)傷性關節(jié)炎的發(fā)病率有增加的趨勢。至今，人們對軟骨損傷后的自然演變過程還不夠十分了解，創(chuàng)傷性骨關節(jié)炎的發(fā)病機制仍不十分清楚[2]。

近幾年的研究表明關節(jié)軟骨不僅能夠誘導潛在的自身免疫反應，還可使自身免疫反應持續(xù)發(fā)揮作用。有文獻報道[3-4]，關節(jié)損傷后免疫系統(tǒng)及骨骼系統(tǒng)相互作用，導致創(chuàng)傷性關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展。

T細胞的有效活化和效應的發(fā)揮需要共刺激信號，B7-H4是共刺激因子B7家族的新成員，它可以通過抑制T細胞增殖、細胞周期進行以及細胞因子分泌發(fā)揮其負調控作用[5]，體內實驗顯示B7-H4還可作為嗜中性粒細胞免疫應答的負調節(jié)因子，在天然免疫過程中發(fā)揮重要作用[6]。

通過前期的研究，我們已經構建、表達并純化了小鼠B7-H4-Fc融合蛋白，建立了以牛Ⅱ型膠原誘導的小鼠關節(jié)炎模型（CIA模型），并在體外證實B7-H4參與T細胞活化的負調節(jié)，同時發(fā)現(xiàn)B7-H4-Fc融合蛋白對CIA小鼠有一定的治療作用。目前筆者開始關注B7-H4在創(chuàng)傷性關節(jié)炎中的作用及應用的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性成年SD大鼠52只（第三軍醫(yī)大學動物實驗中心提供），體重200~300 g。隨機分為實驗組、對照組兩組，每組26只。

1.2 主要試劑及儀器

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國R&D公司），磷酸緩沖液（PBS）（第三軍醫(yī)大學免疫教研室提供）。

1.3 試驗方法

1.3.1 模型的建立 兩組大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉成功后，實驗組用切斷右側膝關節(jié)內側副韌帶和切除部分內側半月板的方式建立大鼠創(chuàng)傷性關節(jié)炎模型[7-8]，在無菌條件下行右膝內側髕骨旁切口，長約2 cm，依次切開皮膚、皮下組織、深筋膜、切斷外側副韌帶，打開關節(jié)囊，直視下探查關節(jié)腔無原發(fā)病變后，用眼科剪完整切除內側半月板，用生理鹽水、慶大霉素沖洗關節(jié)腔，1號絲線逐層縫合，無菌包扎；對照組依次切開皮膚、皮下組織、深筋膜、關節(jié)囊，用生理鹽水、慶大霉素沖洗關節(jié)腔，1號絲線逐層縫合，無菌包扎。

1.3.2 標本采集 術后24 h、48 h，1、2、4周5個時間點， 行麻醉后在髕上囊部位關節(jié)腔注入1 ml無菌PBS灌洗，反復活動關節(jié)后，仔細抽取灌洗液，做好標記后立即置于-70℃冰箱中保存?zhèn)洳椤?/p>

1.3.3 B7-H4檢測 采用ELISA方法進行標本含量檢驗。所有標本采集后，實驗前30 min配制好ELISA試劑（按照說明書），分別取每份關節(jié)腔灌洗液進行B7-H4含量檢測。步驟按照ELISA試劑說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 12.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，實驗數(shù)據(jù)均值間差異比較采用t檢驗，兩組間比較用t檢驗，多組間比較采用多個獨立樣本的Kruskal-Wallis檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實驗結果處理

實驗過程中死亡12只，其中實驗組死亡8只，對照組死亡4只。最后剔除5只體重過輕的大鼠的實驗數(shù)據(jù)，其中實驗組2只，對照組3只，進入統(tǒng)計實驗組16只，對照組19只。

2.2 B7-H4的表達

由表1可見，對照組術后各時間點B7-H4含量表達均較低，且各時間點B7-H4含量差異無統(tǒng)計學意義；而實驗組術后各時間點B7-H4含量均高于對照組（均P<0.05）。從表2及表3我們得出結果，實驗組術后48 h膝關節(jié)液中B7-H4含量較其他時間點明顯增高（P<0.05），術后2周B7-H4表達較術后 48 h 明顯降低（P<0.05）；術后 48 h，2、4 周 3 個時間點的B7-H4表達呈降低趨勢。

3 討論

創(chuàng)傷性關節(jié)炎主要是負重關節(jié)創(chuàng)傷后的一種后遺癥，是繼發(fā)于關節(jié)創(chuàng)傷的骨關節(jié)炎，受傷后發(fā)病時間長短不一，臨床主要表現(xiàn)為受累關節(jié)的疼痛、不同程度的關節(jié)活動障礙，嚴重者有畸形改變，甚至致殘。創(chuàng)傷性關節(jié)炎的發(fā)生由多種原因造成，它曾經被認為是非炎癥性疾病，然而近期的很多研究支持炎癥是創(chuàng)傷性關節(jié)炎的病理變化過程中的重要環(huán)節(jié)[9]。Scanzello等[10]發(fā)現(xiàn)細胞炎性因子廣泛參與創(chuàng)傷性關節(jié)炎的免疫發(fā)病機制，在創(chuàng)傷性關節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。

表1 B7-H4在各組中的表達（ ±s）

表1 B7-H4在各組中的表達（ ±s）

P值24 h 48 h 1周2周4周各時間點 實驗組0.137±0.014 0.437±0.028 0.287±0.093 0.192±0.032 0.102±0.010對照組0.020±0.008 0.017±0.006 0.009±0.007 0.023±0.004 0.037±0.007<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

表2 實驗組中B7-H4在48 h點表達與其他各點的比較（ ±s）

表2 實驗組中B7-H4在48 h點表達與其他各點的比較（ ±s）

注：與 48 h 比較，*P＜0.05

B7-H4實驗組 其他時間點24 h 48 h 1周2周4周B7-H4含量0.137±0.014*0.437±0.028 0.287±0.093*0.192±0.032*0.102±0.010*

表3 實驗組中B7-H4在48 h、2周、4周三點表達的漸變比較

Donohue最早提出，在胚胎和個體發(fā)育的過程中，軟骨組織大多處在和其機體自身免疫監(jiān)視系統(tǒng)相隔絕的狀態(tài)，然而當軟骨受到某種損傷時，軟骨中的組織成分便可暴露出來，即可誘發(fā)針對自身軟骨成分的免疫反應，產生的抗膠原抗體則可抑制軟骨細胞的DNA、膠原以及硫酸多糖的合成，從而進一步加重軟骨的退變。Yuan等[11]認為軟骨成分的暴露能夠誘導自體免疫性關節(jié)炎的發(fā)生，還會產生細胞因子、趨化因子以及一些具有損傷機體作用的酶，產生的酶和細胞因子會破壞關節(jié)軟骨基質，使部分軟骨抗原反復暴露于免疫系統(tǒng)中，這樣最終導致自體免疫反應發(fā)生。

炎癥因子誘導多克隆B細胞分泌IgM、IgG、IgA，促使T淋巴細胞產生細胞因子及其受體，對T淋巴細胞同時具有趨化與活化的2種作用，同時T淋巴細胞可以激活CD4、CD69、CD25、CD38、CD43、CD45 和組織相容性白細胞抗原（HLA）Ⅱ，產生免疫反應，加重軟骨細胞的破壞[12]。

B7-H4（B7x,B7S1）是B7家族的新成員，其主要表達于活化的B細胞、樹突細胞（DCs），吞噬細胞及腎癌、乳腺癌及非小細胞肺癌等腫瘤組織中[13-16]。早期實驗證實，B7-H4的一個可能受體為B細胞和T細胞衰減子（BTLA）8。最近實驗表明除BTLA外，B7-H4還存在其他受體分子[17]。B7-H4與其受體交叉聯(lián)結后可抑制Th1細胞活化，下調IL-2、IFN等細胞因子的產生。并可加劇實驗變應性腦脊髓炎（EAE）的炎癥，表明B7-H4參與調節(jié)T-B細胞相互作用而下調B細胞產生抗體，并參與調節(jié)效應T細胞的功能及維持外周耐受[13-14]。B7-H4-Fc融合蛋白體外證實其可抑制T細胞的活化[13]，而我們的前期研究中也提示B7-H4-Fc融合蛋白體內干預可延緩內風濕關節(jié)炎的發(fā)展。

在此次實驗中筆者發(fā)現(xiàn)，B7-H4在創(chuàng)傷急性期的關節(jié)中表達增高，其在創(chuàng)傷愈合后期表達逐漸降低，提示B7-H4表達的減弱與創(chuàng)傷后期創(chuàng)傷性關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關。由此我們可以大膽的推測在創(chuàng)傷后期，關節(jié)腔中B7-H4表達減低，對T細胞及B細胞活化的負性調節(jié)減弱，導致T-B細胞大量活化，同時產生大量炎癥因子，體液免疫及細胞免疫的激進推動了創(chuàng)傷性關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展。在下一步的實驗中，我們重點要了解B7-H4在創(chuàng)傷性關節(jié)炎中分別在關節(jié)軟骨及滑膜中的表達情況，并同時與IL-2、IFN對比，了解其相關性。筆者認為B7-H4有望成為診斷及治療創(chuàng)傷性關節(jié)炎的關鍵。

[1]Xiaowei Li,Roger CH,Nieholas JA.An analytical model to study blunt impact response of the rabbit P-F joint[J].J Biomech Eng,1995,117：485-491.

[2]Buckwalter JA.Articular cartilage injures[J].Clin Orthop,2002,14(2)：134-141.

[3]Sato K,Suematsu A,Okamoto K,et al.Th17 func tions as an osteoclastogenic helper T cell subset that links T cell activation and bone destruction[J].J Exp Med,2006,203(12)：2673-2682.

[4]TakayanagiH.Osteoimmunology：sharedmechanismsandcrosstalkbetween the immune and bone systems[J].Nat Rev Immunol,2007,7(4)：292-304.

[5]Ichikawa M.Role of B7-H1 and B7-H4 molecules in down regulating effect or phase of T-cell immunity：novel cancer escaping mechanisms[J].Front Biosci,2005,10：2856-2860.

[6]Zhu G.B7-H4-deficient mice display augmented neutrophil mediated innate immunity[J].Blood,2009,113：1759-1767.

[7]Janiszm J,Bendele AM,Brown KK,et al.Induction of osteoarthritis in the ratbysurgicaltearthemeniscus：inhibitionofjointdamagebyamatrix metall oproteinaseinhibitor[J].OsteoarthritisCartilage,2002,10(10)：785-791.

[8]陳連旭,傅欣,于長隆,等.內側副韌帶切斷合并半月板部分切除對大鼠膝關節(jié)軟骨、滑膜和細胞因子的影響[J].中國運動醫(yī)學雜志,2006,25(6)：655-662.

[9]Mazières B,Garnero P,Guéguen A,et al.Molecular markers of cartilage breakdown and synovtis at baseline as predictors of structural progression of hip osteoarthritis[J].The Echodiah Cohort.Ann Rheum Dis,2006,65(3)：354-359.

[10]Scanzello CR,Umoh E,Pessler F,et al.Local cytokine profiles in knee osteoart hritis：elevated synovial fluid interleukin-15 differentiates early from endstage disease [J].Osteoarthritis and Cartilage,2009,17(8)：1040-1048.

[11]Yuan GH,Masuko Hongo K,Kato T,et al.Immunologic intervention in the pathogenesis of osteoarthritis [J].Arthritis Rheum,2003,48(30)：602-611.

[12]Kinne RW,Liehr T,Beensen V,et al.Mosaic chromosomal aberrations in synovial fibroblasts of patients with rheumatoid arthritis,osteoart hritis and ot her inflammatory joint disease[J].Art hritis Res,2001,3(5)：319-330.

[13]Watanabe N,Gavrieli M,Sedy JR,et al.BTLA is alymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1 [J].Nat Immunology,2003,4(7)：670-679.

[14]Sica GL,Choi IH,Zhu G,et al.B7-H4,a molecule of B7 family,negatively regulates T cell[J].Immunity,2003,18(6)：849-861.

[15]Krambeck AE,Thompson RH,Dong H,et al.B7-H4 expression in renail cell carcimoma and tumor vasculature：associations with cancer progression and survival[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(27)：10391-10396.

[16]Kryczek I,Zou L,Rodriguez P,et al.B7-H4 expression identifies a novel suppressiv macrophage population in human ovarian [J].J Exp med,2006,203(4)：871-881.

[17]Murphy KM,Nelson CA,Sedy JR.Balan cing co-stimulation and inhibition with BTLA and HVEM[J].Nat Rev Immunol,2006,6(9)：671-681.