聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)探討兔脊髓缺血再灌注損傷的時(shí)間規(guī)律

苑福升 ，劉 健 ，高 琦 ，朱本清 ，王海濤 ，閆 鵬 ，楊小玉

1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科，吉林長(zhǎng)春 130021；2.天津人民醫(yī)院骨科，天津 300211

脊髓缺血再灌注損傷是脊柱脊髓外科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，以往的研究主要集中在闡述機(jī)制、解釋空間構(gòu)造方面。我們建立蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)聯(lián)合研究平臺(tái)，試圖從新的角度闡釋脊髓缺血再灌注損傷時(shí)間規(guī)律。

1 蛋白組學(xué)方法

1.1 儀器

Amersham公司IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT Twelve電泳系統(tǒng)、蛋白核酸分析儀、超聲破碎儀。Beckman冷凍離心機(jī)，PROTEAN IEF cell型等電聚焦儀、PROTEAN-11(R)ⅪCell型垂直電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad產(chǎn)品，Thermo冷凝水循環(huán)儀質(zhì)譜儀，Applied Biosystems產(chǎn)品ABI-4800型反射式基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜，Typhoon 9410掃描儀及圖像分析軟件DeCyder v.5.02（Amersham Bioscience）。

1.2 試劑

Cy2、Cy3、Cy5熒光染料購(gòu)自Amersham公司；DMF購(gòu)于SIGMA 公司；裂解液（7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4%CHAPS）、水化液（8 mol/L尿素、2%CHAPS）、平衡母液（6 mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCl、20%甘油、2%SDS）、RCDC 定量試劑盒、10× 電 泳 緩 沖 液 （250 mmol/L Tris、1.92 mol/L glycine、1%SDS）、Bradford定量試劑盒、30%丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=29∶1）、1.5 mol/L Tris-HCl （pH 8.8）、10%SDS 均是Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備和脊髓標(biāo)本采集 清潔級(jí)健康成年新西蘭大白兔由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分3組：假手術(shù)組（I0R0）、缺血30 min組（I30R0）、缺血再灌組（I30R6、12、24、48），每組 6 只。 將其用10%的水合氯醛麻醉，開(kāi)腹后用血管夾在左腎動(dòng)脈分叉下阻斷腹主動(dòng)脈，使脊髓腰骶段缺血。假手術(shù)組和缺血30 min組于術(shù)后麻醉下取脊髓L4～5節(jié)段，缺血再灌注組缺血30 min后去除血管夾閉創(chuàng)，模擬再灌注。再灌注6、12、24、48 h麻醉下活體取脊髓L4～5節(jié)段。液氮速凍-70℃冰箱保存。

1.3.2 樣品制備 液氮研磨組織粉末，按1∶10（W/V）加入lysis buffer。 加蛋白酶抑制劑（Cocktail） 20 μl/ml。 先取一部分lysis溶解樣品粉末，轉(zhuǎn)入Dounce勻漿器中。用剩余buffer清洗容器，再轉(zhuǎn)入Dounce勻漿器中勻漿。將樣品放入冰水混合物燒杯里超聲，21%振幅。累計(jì)超聲60 s，超0.2 s，停1 s（pulse on 0.2，off 2）， 室溫提取 30 min。 離心，40 000 g×1 h/s，4℃離心，取上清，測(cè)量出蛋白濃度后，分裝保存在-80℃冰箱。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)方法 標(biāo)本提取、標(biāo)記及電泳過(guò)程詳見(jiàn)文獻(xiàn)[1]。

1.3.4 圖像掃描及分析 電泳結(jié)束后，掃描儀在488/520 nm，532/580 nm，633/670 nm 波長(zhǎng)分別對(duì) Cy2、Cy3、Cy5 熒光染料標(biāo)記的圖像進(jìn)行掃描。用DeCyder v.5.02圖像分析軟件觀察各蛋白點(diǎn)在缺血和再灌注各時(shí)間點(diǎn)的變化，取正常組與缺血再灌注24 h組比較篩選差異點(diǎn)標(biāo)記描述。

1.3.5 差異點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定 應(yīng)用膠內(nèi)酶切法切取差異點(diǎn)。質(zhì)譜分析采用反射式掃描方式，掃描范圍：700～4000Da；激光能量：一級(jí)質(zhì)量分析器5000 v，二級(jí)質(zhì)量分析器 5 500 v。

1.3.6 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用兔形目數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI全庫(kù)。兔形目數(shù)據(jù)庫(kù)取蛋白質(zhì)評(píng)分＞52分，NCBI全庫(kù)取蛋白質(zhì)評(píng)分＞67分，置信水平在95%以上。

1.4 結(jié)果

選取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物I30R24組相對(duì)于對(duì)照組I0R0組，2倍的差異結(jié)果作為入選對(duì)象，通過(guò)熒光標(biāo)記比較結(jié)果，共選取了49個(gè)差異點(diǎn)，通過(guò)MALDI-TOF-TOF/MS分析酶解后肽碎片的一級(jí)和二級(jí)離子序列。最后基于MASCOT算法的檢索平臺(tái)，分別以NCBI的兔蛋白庫(kù)和物種全蛋白庫(kù)分別檢索，最終獲得了21個(gè)蛋白質(zhì)。根據(jù)灌流過(guò)程中蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化，實(shí)驗(yàn)中所設(shè)定的取樣組（0、6、12、24 和 48 h）繪制變化曲線，見(jiàn)圖 1。

1.5 Western-blot驗(yàn)證分析

選取了24 h下調(diào)蛋白質(zhì)α-tubulin進(jìn)行驗(yàn)證結(jié)果分析，電泳上樣次序根據(jù)缺血后灌注的時(shí)間順序，與蛋白質(zhì)分析曲線序列完全一致。

2 代謝組學(xué)方法

2.1 材料與方法

2.1.1 主要儀器與裝置試劑

氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（GC-TOF-MS）：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；DB-5MS 柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；電子分析天平（BS124S）為德國(guó)Startorius公司產(chǎn)品，Masslynx 4.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，英國(guó)Micromass公司產(chǎn)品；Nist 02數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.1.2 主要試劑

核糖醇（內(nèi)標(biāo)）：由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；甲醇、正己烷（色譜純）：Merck公司產(chǎn)品；其他標(biāo)準(zhǔn)試劑均為國(guó)產(chǎn)。分析純實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Milipore公司）純化的純凈水。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與處理

同蛋白質(zhì)組學(xué)研究組實(shí)驗(yàn)新西蘭兔，隨機(jī)分為3組：第1組為正常假手術(shù)組 （I0R0，K），第2組為脊髓缺血30 min（I30R0，M）， 第 3 組缺血 30 min， 再灌注 24 h 組（I30R24，H）。復(fù)制動(dòng)物模型同前。分別于假手術(shù)后，缺血30 min及再灌注24 h采集門靜脈血，用1%肝素鈉抗凝，3 000×g離心10 min后，取血漿-20℃保存待測(cè)。

2.1.4 實(shí)驗(yàn)條件

2.1.4.1 色譜條件：色譜柱：DB-5MS（30.00 mm×0.25 mm,0.25 μm）；升溫程序：柱初溫50℃,以30℃/min升溫至160℃，保持1 min，以4℃/min升溫至240℃，保持1 min；以30℃/min升溫至280℃，保持 3 min；進(jìn)樣溫度 260℃；載氣為超純氦（99.9996%），柱流量（恒流）：1 ml/min；進(jìn)樣量 0.3 ml。

2.1.4.2 質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度250℃，離子源溫度220℃，電離方式EI+，檢測(cè)質(zhì)荷比范圍：50～800 m/z。

2.1.4.3 多維統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果：試驗(yàn)中采用非監(jiān)督的主成分分析（PCA）對(duì)K、M和H組的血清代謝物進(jìn)行分析，建立二維PCA數(shù)學(xué)模型OPLS-DA模型的載荷圖。

2.2 結(jié)果

采用氣相色譜聯(lián)合質(zhì)譜分析（GC-MS）的方法分析測(cè)定血清中代謝物并用PCA、OPLS-DA等多維統(tǒng)計(jì)方法區(qū)分假手術(shù)組和不同時(shí)段（30 min，24 h）缺血再灌注損傷組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了51種差異代謝物物質(zhì)組成的代謝標(biāo)志物組 （其中一個(gè)為內(nèi)標(biāo)物）。代謝產(chǎn)物的成分及對(duì)比差異詳見(jiàn)表1、2。

表1 假手術(shù)組（K）、術(shù)后24 h組（H）比較

表2 術(shù)后30 min組（M）與術(shù)后24 h組（H）比較

代謝產(chǎn)物主要分為糖類、氨基酸、脂類等。K組和H組對(duì)照，代謝產(chǎn)物偏高主要集中在半乳糖、未知糖、甘油、硬脂酸、6-脫氧吡喃甘露糖、軟脂酸、尿素、肌醇；M和H組對(duì)照，代謝產(chǎn)物偏高主要集中在：葡萄糖、半乳糖、軟脂酸、尿素、甲氧基丙二酸、甘氨酸、硬脂酸、5-氧基脯氨酸。

3 討論

建立和完善蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，可從蛋白組、代謝組兩個(gè)水平檢測(cè)目的樣品的非期望效應(yīng)，非選擇性、無(wú)偏倚的方式篩選出被研究對(duì)象在細(xì)胞或組織水平的病理生理或代謝水平的潛在變化[2]。

DIGE在差異蛋白質(zhì)分析方面穩(wěn)定、可靠。在數(shù)據(jù)庫(kù)檢索上，借鑒Vissers等[3]的經(jīng)驗(yàn)，采用兔形目數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI全庫(kù)進(jìn)行互補(bǔ)分析的策略。分時(shí)段采樣的蛋白質(zhì)差異表達(dá)的結(jié)果上獲得若干組動(dòng)態(tài)的變化曲線，變化趨勢(shì)顯示，損傷的24 h是主要改變關(guān)鍵點(diǎn)，在此前后蛋白質(zhì)的表達(dá)水平基本一致。

重點(diǎn)神經(jīng)蛋白質(zhì)如神經(jīng)纖維蛋白M （neurofilament M,NFM），在上調(diào)和下調(diào)模式中均出現(xiàn)，其在應(yīng)激后受雌二醇的誘導(dǎo)表達(dá)以恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞的功能[4]，損傷前期該蛋白質(zhì)表達(dá)下降，而后保護(hù)性地上升以恢復(fù)神經(jīng)元的功能，因此推測(cè)，保護(hù)性機(jī)制發(fā)生于再灌注24 h。另一個(gè)神經(jīng)蛋白是span2，該蛋白參與神經(jīng)元膜的穩(wěn)定性的保持，Indraswari等以腦缺血小鼠為模型發(fā)現(xiàn)spna2的mRNA表達(dá)上調(diào)，參與缺血保護(hù)[5]。在結(jié)果中其蛋白質(zhì)表達(dá)水平在24 h明顯下調(diào)，表明該蛋白在缺血損傷前期發(fā)揮不同的作用。

膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）24 h表達(dá)量下降，之后表達(dá)水平恢復(fù)。膠質(zhì)纖維酸性蛋白被認(rèn)為是脊髓損傷的標(biāo)志性蛋白。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果構(gòu)建的數(shù)學(xué)模型顯示，蛋白表達(dá)量變化總體趨勢(shì)呈現(xiàn)24 h“瀑布式”下降，而其余時(shí)間點(diǎn)變量很小的特征，Woolf等也通過(guò)免疫組化分析周圍神經(jīng)損傷時(shí)觀察到，糖原磷酸化酶（PYGM）在24 h表達(dá)有一個(gè)瞬時(shí)降低[6]，因此推測(cè)在脊髓損傷中，糖代謝的酶表達(dá)水平的降低可以在一定程度上降低葡萄糖的消耗，使體內(nèi)的葡萄糖維持在較高水平，從而保護(hù)急性應(yīng)激中受損的神經(jīng)。

保守的熱休克蛋白（HSP）是細(xì)胞對(duì)缺血、缺氧等應(yīng)激反應(yīng)敏感而可靠的標(biāo)記，對(duì)應(yīng)激細(xì)胞起保護(hù)作用[7]。最近有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，脊髓損傷組大鼠在脊髓損傷后2 h即有HSP70開(kāi)始表達(dá)，并隨著時(shí)間增加，表達(dá)24 h達(dá)到峰值，維持至72 h后表達(dá)漸少，低于6 h水平[8]，與HSP相關(guān)的輔助因子熱激活蛋白70識(shí)別蛋白A（HSC70）在24 h下降達(dá)到低谷而后升高，此過(guò)程表明初期應(yīng)激后機(jī)體內(nèi)在損傷保護(hù)機(jī)制啟動(dòng)，與HSP70聯(lián)動(dòng)，其誘導(dǎo)的數(shù)量與保護(hù)作用的強(qiáng)弱呈正相關(guān)[9]。

琥珀酸脫氫酶、烯醇酶等參與碳水化合物代謝和能量代謝的酶類在24 h時(shí)間點(diǎn)上也呈現(xiàn)下降的特征，但是目前仍缺少其在神經(jīng)損傷研究中的作用機(jī)制證據(jù)。

代謝組學(xué)方面，由于所檢測(cè)的許多內(nèi)源性小分子化合物直接參與了體內(nèi)各種代謝、循環(huán)，其水平高低在一定程度上反映了機(jī)體生化代謝的功能和狀態(tài)，通過(guò)代謝網(wǎng)絡(luò)分析還能了解體內(nèi)生化代謝狀態(tài)，溝通生化代謝與疾病關(guān)系[10]。氣質(zhì)聯(lián)用（GC-TOF/MS）在掃描模式下不但具備了廣譜測(cè)定、強(qiáng)大的分離和分析復(fù)雜混合物的能力，還擁有很高的靈敏度、良好的重現(xiàn)性和線性響應(yīng)[11-12]可以同時(shí)測(cè)定定性幾百個(gè)化學(xué)性質(zhì)不同的化合物。其龐大的化合物譜圖庫(kù)也極大地方便了未知化合物的鑒定。

代謝產(chǎn)物分析方面，高能磷酸化合物，如磷酸肌酸（P2Cr）、三磷酸腺苷（ATP）的耗竭及葡萄糖、糖原的耗竭被認(rèn)為是缺血性損傷最敏感和最可靠的代謝指標(biāo)。葡萄糖在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)換為丙酮酸后，缺氧時(shí)氧化磷酸酶活力下降，糖酵解產(chǎn)生的H＋與丙酮酸結(jié)合形成乳酸，其作為疲勞物質(zhì)，量的升高可以在某種程度上反映細(xì)胞缺血缺氧的狀態(tài)。本試驗(yàn)中假手術(shù)組（K）、術(shù)后 30 min 組（M）、術(shù)后 24 h 組（H）比較：在假手術(shù)組與術(shù)后24 h組比較中（表1），出現(xiàn)明顯高峰的產(chǎn)物，假手術(shù)組為葡萄糖，術(shù)后24 h組為乳酸，說(shuō)明葡萄糖消耗明顯。而術(shù)后30 min組與術(shù)后24 h組比較（表2），術(shù)后24 h出現(xiàn)半乳糖與未知名稱的糖明顯較術(shù)后30 min組高。半乳糖也可以通過(guò)半乳糖激酶等作用下進(jìn)入酵解途徑。其他糖類如6-脫氧吡喃甘露糖也可通過(guò)變位酶轉(zhuǎn)變成磷酸己糖而半乳糖激酶等作用下進(jìn)入酵解途徑。其他糖類如6-脫氧吡喃甘露糖也可通過(guò)變位酶轉(zhuǎn)變成磷酸己糖而進(jìn)入酵解途徑，由此可推斷在術(shù)后24 h中，糖代謝已經(jīng)達(dá)到峰值，趨向于向正常方向回歸正常代謝變化。此外甘油是細(xì)胞膜的組成部分，研究表明甘油的濃度變化可能反映細(xì)胞膜損傷的程度[13]。

綜上所述，通過(guò)對(duì)缺血再灌注損傷兔模型蛋白質(zhì)組和代謝組的分析，筆者認(rèn)為，脊髓缺血再灌注后的24 h是關(guān)鍵性變化點(diǎn)，神經(jīng)蛋白部分受損嚴(yán)重，影響模型動(dòng)物的神經(jīng)支配運(yùn)動(dòng)能力。在這種狀態(tài)下機(jī)體應(yīng)激啟動(dòng)了相關(guān)的保護(hù)機(jī)制，主要以降低糖代謝酶類來(lái)維持相當(dāng)水平的血糖濃度，同時(shí)為了對(duì)受損蛋白質(zhì)進(jìn)行修復(fù)和重疊以恢復(fù)其功能，機(jī)體啟動(dòng)熱激活蛋白等相關(guān)修復(fù)的因子。而代謝產(chǎn)物中，葡萄糖及其他多種己糖在缺血再灌注損傷24 h的時(shí)候，達(dá)到代謝的峰值，逐漸開(kāi)始趨向于向正常方向，回歸正常代謝變化。

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