納米金放大SPR技術(shù)檢測前列腺癌腫瘤標志物free PSA

陳勝華，王文武，向 娟

(1．中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長沙410083;2．中州大學(xué)化工食品學(xué)院，鄭州450044)

1． 緒論

腫瘤標志物檢測是腫瘤普查、診斷和預(yù)后的主要技術(shù)手段之一。前列腺癌腫瘤標志物前列腺特異性抗原(prostate－specific antigen，PSA)是前列腺癌診斷的標志物，對其檢測可以有效的檢測和預(yù)防前列腺癌的發(fā)生［1－2］。PSA 又可以分為 f－PSA 和PSA －ACT［3］，近年來發(fā)現(xiàn)檢測 f－ PSA，并且比較 f－PSA/t－PSA的比值可以有效的區(qū)分前列腺增生和前列腺癌，特別是在診斷灰色區(qū)(PSA濃度在4－10 ng/mL)，可以有效地提高診斷真實性，降低誤診率。表面等離子體激元共振(surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)［4］是一種基于芯片表面折射率變化的光學(xué)檢測技術(shù)，具有快速、靈敏、免標記等優(yōu)點，可實時在線地跟蹤固液界面反應(yīng)，在蛋白及核酸等生物分子檢測方面具有廣闊的應(yīng)用前景。但是，傳統(tǒng)的SPR檢測方法難以檢測低分子量、超低濃度的生物分子。f－PSA在人血清中的濃度非常低，直接利用傳統(tǒng)的SPR技術(shù)很難檢測。而納米金具有密度大、介電常數(shù)大、良好的生物相容性，可以極大的增強SPR信號［5－6］。因此，我們結(jié)合兩者的優(yōu)點，設(shè)計出基于納米金放大的SPR技術(shù)檢測f－PSA，這種方法既可保持生物分子的生物活性，又可有效突破傳統(tǒng)SPR的限制。

2． 實驗部分

2．1 試劑

實驗所用的載液為磷酸緩沖液(PBS，15 mmol/L，pH=7．4 包含0．85%NaCl)，使用前用0．22 － μm的膜過濾器進行過濾，且避光存于冰箱內(nèi)待用。11－巰基十一酸(MUA)溶解純酒精中(10 mmol/L);羧基活化劑 NHS(0．1 mol/L)和 EDC(0．4 mol/L)、氨基乙醇(AE 1 mol/L)、游離前列腺特異性抗體(anti－f－PSA)、均溶解在PBS緩沖液中。游離前列腺特異性抗原(f－PSA)溶解在醋酸鈉緩沖液(10 mmol/L，pH=5．6 包含 0．85%NaCl)。實驗所用試劑均為分析純。所有溶液均用18．0 M·cm的超純水配置。

2．2 儀器

實驗采用由美國BI公司研制的BI－3000 SPR雙通道檢測系統(tǒng)，配備有美國Kent Scientific公司的流動注射泵(型號Genie Plus)，構(gòu)建成流動注射表面等離子體激元共振 (FI－SPR)裝置。此裝置含六個流通閥，流通池的進樣端與六通閥的一端相連，六通閥上進樣環(huán)的體積為200 μl。實驗時用注射器將載液注入注射泵上，在流動注射泵的推動下，載液流經(jīng)六通閥后流過流通池，如果進樣環(huán)中注入了檢測樣品，載液將會把樣品帶入流通池進行分析檢測，計算機將實時的記錄時間與角度變化感應(yīng)圖。

2．3 SPR 芯片制備

將BK7蓋玻片先用水虎魚(雙氧水:濃硫酸=3:7，體積比)在80°C條件下煮約30分鐘，隨后用二次去離子水清洗干凈玻片上的濃硫酸，放置氨水中(水∶濃氨水∶雙氧水 =5∶1∶1，體積比)，超聲 20分鐘，然后用二次去離子水沖洗干凈，N2吹干。處理干凈后的玻片放到真空磁控濺噴鍍膜機(Sputter Coater 108auto/SE，Kert J．Lester Inc．，Clariton，PA)上進行噴鍍，先在玻片的表面鍍一層2 nm厚的鉻，隨后在玻片表面鍍一層50nm左右的金［101］，通常鍍鉻的時候，選用的時間是295s，鍍金選用的時間是295s。組裝修飾芯片前先可用氫火焰進行退火，以除去金膜表面的雜質(zhì)和附著物，或者將金膜用水虎魚快速清洗，去除金膜表面雜質(zhì)。首先需將處理干凈的金膜在浸泡10 mmol/L11－巰基十一酸(MUA)水溶液中，在室溫下避光浸泡12小時，使其表面形成一層規(guī)則的巰基自組裝單分子層;依次用酒精溶液、二次水清洗金膜，氮氣吹干金膜備用。

2．4 納米金復(fù)合物制備

納米金采用一步法檸檬酸鈉還原制備。0．125 mg/ml f－PSA與納米金溶液混合于 pH 9的0．1 mol/L的K2CO3溶液中，振蕩4小時，然后再4℃下以9000r/min速度冷凍離心25 min。移去上層清液，以去除多余的未結(jié)合的蛋白，沉淀用pH 7．4的15 mmol/L的PBS稀釋。

3． 結(jié)果與討論

由于作為腫瘤標志物的f－PSA的分子量僅為30 kD，如果在傳感芯片上面直接檢測，當(dāng)檢測到低濃度，特別是納克級的水平時，SPR信號受到儀器的限制而難以獲得。本文采用納米金放大信號檢測f－PSA，其檢測原理見圖1。首先，在金膜表面通過特異性的免疫反應(yīng)形成anti－f－PSA－f－PSA或者Au－f－PSA復(fù)合物。芯片表面首先固定單分子層的anti－f－PSA，然后注射不同濃度的f－PSA，最后注射固定濃度的Au－f－PSA復(fù)合物與anti－f－PSA發(fā)生免疫反應(yīng)，芯片表面固定的f－PSA越少，anti－f－PSA裸露的位點越多，當(dāng)最后注入Au－f－PSA復(fù)合物后，與基底裸露的anti－f－PSA特異性免疫結(jié)合產(chǎn)生的SPR信號越大。顯然，競爭型免疫模式在低濃度檢測中具有獨特的優(yōu)勢。

圖1 競爭型免疫反應(yīng)模式SPR檢測原理示意圖(為了清晰表示，圖中分子及納米金均未按實際比例給出)

圖2所示為競爭型免疫模式檢測f－PSA的SPR響應(yīng)曲線圖。圖中虛線所示為沒有注射f－PSA的控制實驗，Au－f－PSA復(fù)合物直接與基底的anti－f－PSA特異性結(jié)合，理論上產(chǎn)生最大的SPR信號，其信號變化為198 mDeg。圖中實線為此實驗的一個主體實驗，圖中檢測的f－PSA的濃度為5 g/mL，由此產(chǎn)生的SPR信號有108 mDeg變化，當(dāng)Au－f－PSA復(fù)合物注入后，其產(chǎn)生的信號僅為9 mDeg。這個時候可以認為Au－f－PSA復(fù)合物基本上不與基底的anti－f－PSA作用。當(dāng)檢測的 f－PSA的濃度減小時，基底上將剩余抗原結(jié)合位點，當(dāng)Au－f－PSA復(fù)合物注入后便會與基底作用，產(chǎn)生信號。當(dāng)檢測的f－PSA濃度逐漸降低時，Au－f－PSA復(fù)合物產(chǎn)生的信號逐漸增多，最后基本上達到控制實驗的198 mDeg．

圖2 競爭型免疫模式檢測f－PSA的SPR響應(yīng)信號圖

對于濃度大于5 ng/ml的f－PSA，可以直接通過SPR檢測，SPR不需要納米金等的放大作用，直接可以檢測。并且在一定的濃度范圍內(nèi)(5 ng/ml～50 ng/ml)存在一定的線性關(guān)系。對低于5 ng/ml的f－PSA，直接利用SPR檢測，很難檢測到信號變化。f－PSA在人血清中的濃度一般較低，即便是患有前列腺癌的患者血清中濃度也有低于納克級每毫升的濃度，所以直接利用SPR檢測人血清中的f－PSA的濃度遠遠不能達到診斷的目的，因此利用納米金復(fù)合物放大SPR檢測信號，從而降低f－PSA檢測的的檢測下限，達到診斷前列腺癌的目的。建立的競爭型免疫反應(yīng)模式也是基于 anti－f－PSA/f－PSA和anti－f－PSA/Au－f－PSA之間的特異性作用。從圖3可以明顯的看出，其納米金復(fù)合物有明顯的放大作用，由于所采用的是競爭結(jié)構(gòu)，所以當(dāng)濃度檢測的f－PSA濃度越低時，納米金的放大信號就越大。通過這種免疫競爭法，觀察SPR共振角度變化，可以很容易的檢測出低濃度的f－PSA(0．05 ng/mL至5 ng/ml)。

圖3 競爭型免疫模式檢測f－PSA，Au－f－PSA復(fù)合物的SPR信號與f－PSA濃度的關(guān)系曲線圖

從圖3可以看出，Au－f－PSA信號與f－PSA的濃度在整個檢測區(qū)域內(nèi)不成線性關(guān)系。假設(shè)anti－f－PSA與f－PSA的反應(yīng)遵從Langmuir吸附等溫式假定的準一級反應(yīng)，通過吸附和解離平衡公式的推導(dǎo)得到以下公式:

式中Γf－PSA代表f－PSA在傳感表面的覆蓋度，也就是相當(dāng)于SPR角度偏移值，Cf－PSA代表f－PSA的濃度，Kf－PSA代表抗原抗體反應(yīng)平衡常數(shù)。當(dāng)Cf－PSA濃度極低時，即 Kf－PSACf－PSA? 1 時，則可以得到以下公式:

由于我們實驗過程中采用的是競爭模式檢測，所以，anti－f－PSA不僅與 f－PSA結(jié)合，剩余的結(jié)合位點還會與Au－f－PSA結(jié)合。根據(jù)Langmuir吸附等溫式，在反應(yīng)達到平衡時有:

式中，KAu為抗體與納米金蛋白復(fù)合物反應(yīng)平衡常數(shù)，ΓAu代表納米金復(fù)合物的表面覆蓋度，也表示的是納米金復(fù)合物的SPR角度偏移值。C0代表納米金復(fù)合物的濃度值。如公式(4)所示，當(dāng)C0的濃度極低時，即KAuC0?1時，那么可以得到以下的公式:

從公式(5)可以看出，當(dāng)f－PSA濃度極低時，納米金復(fù)合物的SPR角度偏移值與f－PSA的濃度是成線性關(guān)系的，而且是成反比例關(guān)系的。

圖4 Au－f－PSA復(fù)合物的SPR信號與f－PSA低濃度下的的關(guān)系曲線圖

圖4為低濃度(0 ～2．5 ng/ml)下，Au－f－PSA復(fù)合物的SPR信號與f－PSA低濃度下的的關(guān)系曲線圖。通過線性擬合發(fā)現(xiàn):當(dāng)f－PSA濃度范圍為(0．05 ng/ml～2．5 ng/ml)時，Au －f－PSA 與基底anti－f－PSA特異性作用所產(chǎn)生的SPR角度變化與所檢測的f－PSA濃度成良好的線性關(guān)系。其線性回歸方程為(Y= －35X+187，R2=0．98，其中 Y 代表SPR角度偏移值，X代表f－PSA濃度(ng/ml)相對標準偏差為3．0)。這與我們理論推出來的結(jié)果一致，即在低濃度下存在一定的線性關(guān)系。在實驗中我們所達到的檢測下限為0．05 ng/ml，這個檢測水平已經(jīng)達到前列腺癌早期診斷的檢測標準。

4． 結(jié)論

本文采用納米金放大SPR技術(shù)實現(xiàn)了前列腺癌腫瘤標志物f－PSA在線檢測。利用抗原－抗體特異性相互作用，設(shè)計了競爭型檢測模式進行超靈敏檢測。結(jié)果顯示:當(dāng)檢測f－PSA濃度越低時，Au－f－PSA復(fù)合物與基底anti－f－PSA結(jié)合產(chǎn)生的信號越大。當(dāng)檢測的濃度范圍為0．05 ng/ml至2．5 ng/ml時，Au－f－PSA所產(chǎn)生的SPR角度變化與所檢測的f－PSA濃度成良好的線性關(guān)系。此方法能夠檢測0．05 ng/ml的水平，已經(jīng)達到診斷前列腺癌早期診斷的標準。

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