接塵工人血清中抗核因子、人抗中性粒細(xì)胞漿抗體水平的檢測(cè)

王明君，孫雁玲，汪涵，姚武，郝長(zhǎng)付

(1.中國(guó)平煤神馬能源化工集團(tuán)有限責(zé)任公司醫(yī)療集團(tuán) 河南 平頂山 467000;2.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與職業(yè)病學(xué)教研室 河南 鄭州 450001)

塵肺病是目前中國(guó)職業(yè)病中最嚴(yán)重的一類，但迄今為止，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)對(duì)塵肺病進(jìn)行了大量的相關(guān)研究，但塵肺病的形成機(jī)制目前還不十分清楚，另外，在塵肺病的早期預(yù)防、早期診斷以及接塵人群監(jiān)測(cè)等方面也依然缺乏有效的檢測(cè)指標(biāo)，因此，積極預(yù)防并盡早診斷對(duì)于增進(jìn)病人生存質(zhì)量及延長(zhǎng)壽命尤為重要［1］。Otsuki［2］等認(rèn)為矽肺的發(fā)生與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)變化密切相關(guān)，Wu等［3］認(rèn)為塵肺病的發(fā)生之前可能出現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)的T細(xì)胞減少?？傊?，在塵肺發(fā)病過程中，塵肺患者機(jī)體免疫功能異常已屬無疑，但還有些問題尚未得到解答，為了探討自身免疫抗體在塵肺病發(fā)生、發(fā)展中的意義，進(jìn)一步篩選塵肺病相關(guān)生物標(biāo)志物，本研究以接塵工人為研究對(duì)象，采用ELISA法檢測(cè)研究對(duì)象血清中抗核因子(ANA)、人抗中性粒細(xì)胞漿抗體(cANCA)的表達(dá)水平，探討其變化水平與粉塵暴露之間的可能關(guān)聯(lián)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 接塵組:河南省某煤業(yè)集團(tuán)119例男性煤礦工人，年齡21～59歲，平均年齡為:(38.61±8.99)歲;接塵年限1～36年，平均年限為(17.74±9.92)年。對(duì)照組:鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院男性健康體檢者84例，無粉塵接觸職業(yè)史，均排除心、腦、肝、腎等臟器的纖維化性疾病以及免疫疾病，年齡25～53歲，平均年齡為(45.50±9.55)歲。研究對(duì)象均知情同意。

1.2 樣品采集 全部研究對(duì)象取清晨空腹靜脈血3 ml，靜置 30min后，離心分離血清(3 000r/min，10min)，置－20℃保存待用。

1.3 自身免疫抗體的檢測(cè) 采用雙位點(diǎn)夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測(cè)定血清自身免疫抗體ANA、cANCA的含量，自身免疫抗體試劑盒由安迪生物科技(上海)有限公司生產(chǎn)，操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，質(zhì)量控制和定標(biāo)結(jié)果均在要求范圍內(nèi)。

①分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)樣品孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl;在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl。每空加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。輕輕晃動(dòng)搖勻，37℃溫育60min。

②棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，震蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，如此重復(fù)5次，拍干。

③每孔加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩均勻，37℃避光顯色1 min。

④取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)。

⑤測(cè)定:以空白孔調(diào)零，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度值。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min內(nèi)進(jìn)行。

⑥根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度。由于樣品經(jīng)過稀釋，所以其實(shí)際濃度應(yīng)再乘以總稀釋倍數(shù)。

⑦根據(jù)試劑盒說明書自身免疫抗體陽性判斷的閾值為 ANA 562.5 ng/L、cANCA 375 ng/ml。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以()表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以四格表形式表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 接塵組與對(duì)照組血清中自身免疫抗體 ANA、cANCA含量和陽性率的比較 由表1可見，接塵組血清中自身免疫抗體ANA、cANCA的表達(dá)水平均高于接塵組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。由表2可見，接塵組血清中自身免疫抗體ANA、cANCA表達(dá)的陽性率高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 接塵組與對(duì)照組血清自身免疫抗體ANA、cANCA含量()

表1 接塵組與對(duì)照組血清自身免疫抗體ANA、cANCA含量()

注:*方差齊性檢驗(yàn)P＜0.05，方差不齊;#方差齊性檢驗(yàn)P＞0.05，方差齊。

組別 n ANA(ng/L) cANCA(ng/L)接塵組0.001 0.001 119 401.79 ±96.11 356.68 ±123.16對(duì)照組 84 268.85 ±85.61 174.77 ±85.22 t 11.700# 18.445*P

表2 接塵組與對(duì)照組血清自身免疫抗體ANA、cANCA陽性率的比較

2.2 接塵組血清中自身免疫抗體含量與年齡的相關(guān)性分析 由表3可見，自身免疫抗體ANA、cANCA在接塵組中各年齡組間的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)分析(見表4)，接塵組自身免疫抗體 ANA、cANCA含量與年齡無相關(guān)性(P＞0.05)。

表3 接塵組不同年齡工人血清自身免疫抗體含量()

表3 接塵組不同年齡工人血清自身免疫抗體含量()

年齡(歲) n ANA(ng/L) cANCA(ng/ml)＜41 61 405.07 ±12.41 348.19 ±13.9041～ 58 398.34 ±12.60 365.61 ±18.03 t 0.723 0.770P 0.471 0.443

表4 接塵組工人血清中自身免疫抗體ANA、cANCA含量與年齡的相關(guān)性

2.3 接塵組血清中自身免疫抗體含量與工齡的相關(guān)性分析 由表5可見，自身免疫抗體ANA、cANCA在接塵組不同接塵工齡層間血清含量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。由表6可見，自身免疫抗體ANA、cANCA在接塵組血清中的含量與工齡無相關(guān)性(P＞0.05)。

表5 接塵組不同接塵工齡血清中自身免疫抗體含量()

表5 接塵組不同接塵工齡血清中自身免疫抗體含量()

接塵工齡(y) n ANA(ng/L) cANCA(ng/ml)＜11 40 386.48 ±115.55 350.28 ±110.9011～ 22 399.81 ±65.63 361.63 ±107.53 21～ 57 416.40±90.14 359.26 ±137.90F 1.202 0.083 P 0.304 0.920

表6 自身免疫抗體ANA、cANCA在接塵組血清中的含量與工齡的相關(guān)性

3 討論

塵肺是一種肺纖維化疾病，它的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體自身內(nèi)外因素密切相關(guān)，纖維化實(shí)質(zhì)上是機(jī)體對(duì)肺損傷的一種修復(fù)機(jī)制，與多種纖維化有關(guān)的自身免疫抗體密切相關(guān)，它們的表達(dá)反映了受損害程度的大小，預(yù)示了疾病發(fā)展的結(jié)局，在早期的異常表達(dá)亦可做為判斷預(yù)防控制疾病的預(yù)警信息。塵肺患者出現(xiàn)自身抗體，其機(jī)理可能與巨噬細(xì)胞的吞噬活動(dòng)有關(guān)，煤塵細(xì)胞的毒作用使巨噬細(xì)胞吞噬煤塵后變性、壞死、崩解，巨噬細(xì)胞的自身崩解，使細(xì)胞核內(nèi)多種抗體成分暴漏，產(chǎn)生自身免疫抗體，自身抗體含量的升高可反映機(jī)體免疫應(yīng)答的失調(diào)。煤礦工人塵肺和進(jìn)行性大塊肺纖維化的血清學(xué)變化顯示塵肺患者的自身免疫抗體水平比正常人高的多，本次研究的目的就在于探討自身免疫抗體ANA、cANCA在塵肺病早期變化中表達(dá)水平的變化及其意義，探討其做為肺纖維化早期診斷指標(biāo)的可能性。

cANCA是一組以中性粒細(xì)胞漿成分為抗原的自身抗體，已證明對(duì)很多疾病有診斷價(jià)值，并認(rèn)為有致病作用。cANCA的主要靶抗原存在于中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中，不同的抗原各有不同的生化功能，往往與臨床上不同的疾病有關(guān)［4］。ANA包含一組自身抗體，無種屬和器官特異性，見于多種疾病，缺乏特異性。在自身免疫性疾病中，細(xì)胞核常成為自身免疫反應(yīng)的靶子。ANA主要是指對(duì)核內(nèi)成分所產(chǎn)生的抗體，此外也包括對(duì)核內(nèi)成分相同的物質(zhì)所產(chǎn)生的抗體［5，6］。

本研究結(jié)果表明接塵工人血清ANA、cANCA含量高于對(duì)照組，同時(shí)接塵組表達(dá)水平的陽性率也高于對(duì)照組。研究結(jié)果表明，這2種與免疫性疾病有關(guān)的抗體分子可能與粉塵暴露之間存在一定的關(guān)系，有成為粉塵暴露生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)的可能性，但其具體機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。但其與年齡和接塵工齡之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，即與粉塵暴露量之間的關(guān)系尚不能明確，這需要在以后的研究中收集詳細(xì)的粉塵暴露資料來闡明。

總之，接塵工人體內(nèi)存在自身免疫抗體水平的變化，可以進(jìn)一步證明塵肺病患者機(jī)體存在免疫功能的異常變化。因此，自身免疫抗體指標(biāo)有成為粉塵暴露監(jiān)測(cè)，甚至做為早期篩查高危人群生物學(xué)指標(biāo)的可能性，值得進(jìn)行深入的研究。這對(duì)于提高接塵工人及塵肺病患者健康監(jiān)護(hù)、生物監(jiān)測(cè)和早期預(yù)警水平，提高預(yù)防控制效果，具有一定的的實(shí)際意義。

［1］金泰廙，孫貴范.職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)醫(yī)學(xué).第6版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008.182-184.

［2］Otsuki T，Maeda M，Murakami S，et al.Immunological effects of silica and asbestos［J］.Cell Mol Immunol，2007，4(4):261-268.

［3］Wu P，Miura Y，Hyodoh F，et al.Reduced function of CD4+CD25+regulatory T cell fractions in silicosis patients［J］.Int J Immunopathol Pharmacol，2006，19(2):357-368.

［4］李莉，吳若芬.抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體的檢測(cè)及意義［J］.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2006，28(6):205-207.

［5］劉勝勇，張冬平，李學(xué)軍.抗平滑肌抗體、抗核抗體與慢性乙肝肝纖維化程度相關(guān)性研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2008，46(3):450-453.

［6］王自正.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)標(biāo)記免疫學(xué)［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2000.127-128，277-284.