納米金修飾的免疫傳感器直接測定2,4-D的研究

鐘菲菲，章建輝，李 樂，賴燈妮，彭新凱，胡朝暉

（長沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測中心，湖南 長沙 410018）

2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）是一種較使用廣泛的化學(xué)藥品[1]。高濃度2,4-D可以用作除草劑；低濃度2,4-D可作植物生長調(diào)節(jié)劑，因此被廣泛的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。2,4-D作為植物生長調(diào)節(jié)劑能提高坐果率、增大果實(shí)[2]；還有果實(shí)保鮮作用[3]；并能促進(jìn)植物生根、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長[4]，誘導(dǎo)根瘤的形成[5]。2,4-D的水溶性較高，揮發(fā)性較低，在自然界中難以生物降解或直接光解，導(dǎo)致2,4-D易于淋溶遷移進(jìn)入水體[6]和土壤，進(jìn)而在生物體內(nèi)積累，對生物具有較高的急性毒性，在較高劑量時(shí)具有致畸性和潛在的基因毒性，對人類健康和自然生態(tài)環(huán)境都有較大危害[7]。2,4-D在植物體中的含量低及本身的特殊化學(xué)性質(zhì)使得2,4-D的檢測要求高，而目前的檢測方法存在操作復(fù)雜、靈敏度不高、干擾大或?qū)悠非疤幚硪蟾?、樣品需求量大等問題，因此迫切需要尋找檢測2,4-D的新途徑。

筆者利用自組裝技術(shù)和靜電吸附作用，將2,4-二氯苯氧乙酸抗體（anti-2,4-D）固定在由自組裝L-半胱氨酸和靜電吸附納米金修飾的金電極表面，制備出無試劑型的免疫傳感器，用于2,4-D的檢測分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CHI660C電化學(xué)工作站，金電極，Ag/AgCl飽和電極和鉑絲電極均由上海辰華儀器公司提供；2,4-二氯苯氧乙酸抗體（anti-2,4-D）由北京博奧森生物公司提供；電子天平，超聲清洗儀和離心機(jī)由上海生化工程試劑公司提供；2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），BSA，氯金酸和L-半胱氨酸由Sigma公司提供；H2O2（30%，水溶液）和其他試劑均為分析純試劑；試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 免疫傳感器的制備

參照文獻(xiàn)[8]制備免疫傳感器。金電極（∮＝2 mm）分別用 1.0、0.3、0.05 μm 的 Al2O3粉拋光，然后分別用乙醇、水超聲波清洗5 min，吹干后待用。將洗凈過的金電極放入0.02 mol/L的L-半胱氨酸溶液中，開路自組裝2 h，取出洗凈后，將金電極浸入納米金溶液中4℃過夜，取出后洗凈晾干，即在電極的表面形成自組裝納米金修飾膜，將修飾好的電極置于anti-2,4-D溶液中37℃保持3 h，再用1%BSA封閉電極表面非特異性結(jié)合位點(diǎn)，用水洗滌，晾干，即得無試劑免疫傳感器。

1.3 免疫檢測與分析方法

將2,4-D溶液滴加在免疫電極表面，于37℃條件下孵育30 min，然后用水仔細(xì)清洗后待測。試驗(yàn)采用三電極系統(tǒng)：免疫電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，Ag/AgCl飽和電極為參比電極，以交流阻抗法作為免疫傳感器表征和定性定量的判定方法。在 5 mmol/L K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L PBS（pH 7.0）溶液中，電位為 0.231 V，頻率范圍為0.05～106 Hz，交流電位為5 mV，25℃條件下進(jìn)行交流阻抗表征。

1.4 阻抗分析原理

組裝好的阻抗免疫電極與Ag/AgCl電極和鉑絲電極構(gòu)建的三電極系統(tǒng)浸入5 mL的含K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]的阻抗檢測液中。在阻抗圖譜測試參數(shù)下進(jìn)行，一次測定中進(jìn)行兩次阻抗檢測：2,4-D抗體吸附到電極表面后用BSA封閉多余蛋白吸附位點(diǎn)，此時(shí)檢測阻抗，記為Z0；加入待測2,4-D后，在電極表面形成2,4-D—2,4-D抗體復(fù)合物后檢測阻抗，記為Z1。則添加抗原后傳感器阻抗的增長率為：

不同濃度的2,4-D對應(yīng)不同的△Z/Z0，通過已知濃度的2,4-D和對應(yīng)的△Z/Z0作出標(biāo)準(zhǔn)曲線可以對未知樣品進(jìn)行測定。為獲得阻抗免疫傳感器穩(wěn)態(tài)下的阻抗值，同一狀態(tài)下的電極被反復(fù)測定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器在制備過程中的交流阻抗表征

采用交流阻抗（EIS）表征電極修飾過程，將電極在修飾過程中于5 mmol/L K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L PBS（pH 值7.0）溶液中的交流阻抗表征如圖1。裸電極時(shí)電子傳遞到電極表面只受到擴(kuò)散控制，裸電極的EIS近似一條直線如圖1-a。當(dāng)電極修飾了L-半胱氨酸和納米金后，交流阻抗的膜本體阻抗依次增大，如圖1-b、c，說明電極表面已通過靜電吸附成功地被修飾。納米金修飾的金電極表面掃描電鏡圖見圖2。當(dāng)修飾的電極固定anti-2,4-D，并用BSA封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，電極的界面阻力再度增加，電極修飾過程交流阻抗的變化是抗體已經(jīng)被組裝到電極表面的有力證據(jù)，如圖1-d。當(dāng)電極進(jìn)一步結(jié)合不同濃度的2,4-D后，其阻抗呈增大趨勢（圖1-e），這是因?yàn)榭乖贵w復(fù)合膜的形成，一方面增大了Fe（CN）63-/4-在通過膜時(shí)的阻力，另一方面，也使Fe（CN）63-/4-向電極表面擴(kuò)散的有效截面積進(jìn)一步變小，從而導(dǎo)致膜本身阻抗的增大。

2.2 anti-2,4-D吸附時(shí)間的優(yōu)化

為得出最佳狀態(tài)的工作傳感技術(shù)，獲得準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，需要使電極在較短的時(shí)間里吸附到最好的具有生物活性且固定量大的2,4-D抗體，對anti-2,4-D 的吸附時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，共設(shè)置 1、2、3、4、5、6 h共6個(gè)處理。如圖3所示，在作用1、2 h后，所測得的阻抗變化值不大，說明anti-2,4-D吸附到電極表面上的量不大，還不能滿足試驗(yàn)要求；當(dāng)作用 3、4、5、6 h后，阻抗變化值逐漸加大；說明吸附在電極表面上anti-2,4-D的量也是越來越多。在本試驗(yàn)中，電極表面上anti-2,4-D的吸附量并不是越多越好，而是要確定一個(gè)量，而這個(gè)量，既能有較大量的生物活性的識別物質(zhì)又能便于結(jié)果的分析，通過試驗(yàn)可看出，在吸附3 h后，anti-2,4-D的量即可滿足試驗(yàn)的要求。因此，本試驗(yàn)選取了3 h為最佳a(bǔ)nti-2,4-D吸附時(shí)間。

圖3 anti-2,4-D吸附時(shí)間的影響

2.3 2,4-D與anti-2,4-D作用時(shí)間的優(yōu)化

試驗(yàn)通過對2,4-D與anti-2,4-D的作用時(shí)間的優(yōu)化，來確定抗原與抗體免疫反應(yīng)的最佳程度。設(shè)置 5、15、30、45、60和 80 min共 6個(gè)時(shí)間。將 16 μL的2,4-D溶液滴加在固定了anti-2,4-D的電極表面上，在37℃下作用于設(shè)置的時(shí)間后，雙蒸水清洗，室溫下吹干，測阻抗值。如圖4所示，作用30 min前，阻抗值隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加；當(dāng)作用時(shí)間為30 min時(shí)，結(jié)合反應(yīng)達(dá)到基本飽和程度，而后，隨作用時(shí)間的延長，反應(yīng)基本沒有很大的變化，阻抗響應(yīng)變化非常小。因此，選取了30 min作為2,4-D與anti-2,4-D的最佳作用時(shí)間。

圖4 2,4-D與抗體作用時(shí)間對阻抗變化的影響

2.4 檢測工作液pH值的影響

檢測工作液 pH 值分別為 5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8和8.2時(shí)阻抗值的變化如圖5所示。在pH值5.8到8.2這個(gè)區(qū)間內(nèi)，阻抗值先升高后降低，在pH值7.0的時(shí)候阻抗值達(dá)到最高。這說明在此區(qū)間內(nèi)，免疫電極在pH值7.0的時(shí)候時(shí)工作環(huán)境達(dá)到最理想。這與2,4-D—anti-2,4-D結(jié)合物置于pH值7.0的環(huán)境中能更穩(wěn)定地保持在修飾電極上有關(guān)。在中性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子的表面張力最大，處于一種微弱的水化狀態(tài)，較易吸附于金顆粒的表面，處于穩(wěn)定狀態(tài)，與普通蛋白質(zhì)一樣。2,4-D—anti-2,4-D結(jié)合物在酸性條件下可能會發(fā)生變性，從而影響正常的抗原—抗體免疫結(jié)合物的穩(wěn)定性。因此免疫傳感電極最理想的pH值為7.0。

圖5 不同pH值對2,4-D與抗體反應(yīng)的影響

綜合條件優(yōu)化試驗(yàn)得出，檢測2,4-D的無試劑型免疫傳感器的最佳工作條件為：anti-2,4-D吸附時(shí)間為3 h；2,4-D與anti-2,4-D最佳作用時(shí)間為30 min；檢測工作液最佳pH值為7.0。后續(xù)試驗(yàn)都在這個(gè)條件下進(jìn)行。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

在確定免疫傳感器最優(yōu)參數(shù)后，對濃度為1～5 000 ng/mL的2,4-D進(jìn)行測試，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測試結(jié)果如圖6所示，從圖中可看出：當(dāng)修飾的電極結(jié)合不同濃度的2,4-D，電極的界面阻力不同程度的增加，2,4-D的濃度越大，電極的界面阻力的增加程度越大，免疫傳感器的響應(yīng)信號——交流阻抗越大，從而得到一系列的阻抗曲線。

圖7 在含 5 mmol/L K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]的阻抗液中2,4-D濃度范圍在1～5000 ng/mL繪制的Nyquist圖（Zim vs.Zre），試驗(yàn)均在最優(yōu)化條件下進(jìn)行。

由圖7可知，免疫傳感器阻抗值的變化與溶液中2,4-D濃度成正比，阻抗變化率（y）與2,4-D濃度（x）在2,4-D濃度為1～5 000 ng/mL范圍內(nèi)成線性關(guān)系，回歸方程是y=0.024 6 x+55.092，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 6。根據(jù)3倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差的方法，該免疫阻抗免疫傳感器的的檢測下限為0.5 ng/mL。

2.6 樣品的測定

2.6.1 方法回收率的測定 以0.1 mol/L PBS（pH值7.0）為稀釋液，把標(biāo)準(zhǔn)2,4-D抗原配制成不同濃度的待測品，將該免疫電極置于樣品溶液中培育30 min后，優(yōu)化條件下測定阻抗值，求得待測品中2,4-D的濃度，并得到此方法的回收率在92.0%～102.7%之間。

2.6.2 實(shí)際樣品的應(yīng)用 利用該免疫傳感器對芒果、豆芽、草莓、香橙等5個(gè)樣品中2,4-D含量進(jìn)行測量，并與應(yīng)用普遍的國家標(biāo)準(zhǔn)方法——液相色譜（HPLC）的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果中兩方法的誤差率均在實(shí)驗(yàn)規(guī)范要求之內(nèi)（≤10%），具體結(jié)果見表1。

表1 樣品測試結(jié)果

3 結(jié)論

利用納米金固定2,4-二氯苯氧乙酸抗體（anti-2,4-D）的免疫傳感器直接測定2,4-D。試驗(yàn)結(jié)果表明：在2,4-D濃度為1～5 000 ng/mL范圍內(nèi)響應(yīng)值與濃度成線性關(guān)系，線性方程是y=0.024 6 x+55.092，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)0.998 6，檢測下限為0.5 ng/mL。經(jīng)初步應(yīng)用，證實(shí)此方法能較好的滿足測定2,4-D的需要，是一種快速檢測2,4-D的新途徑。

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