鹽度變化對(duì)鹽藻生物量和總脂含量的影響

韋芳三 ，李純厚 ，戴 明 ，呂國(guó)敏 ，肖雅元 ，胡維安 ，李 琦

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖生態(tài)與質(zhì)量控制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

鹽生杜氏藻（Dunaliella salina Teodoresce）又名鹽藻（Dunaliella salina），隸屬于綠藻門(mén)（Chlorophyta）團(tuán)藻目（Volvocales）多毛藻科（Polyblepharidaceae）杜氏藻屬（Dunaliella,Teodoresco），為低等真核生物[1]。國(guó)內(nèi)外對(duì)海洋綠藻的脂肪含量研究主要集中在小球藻屬Chlorella[2-4]、微綠球藻屬Nannochloris[5-7]、四片藻屬 Tetraselmis[8-9]和杜氏鹽藻屬Dunaliella[4-10]。進(jìn)一步對(duì)11個(gè)屬海洋綠藻的30個(gè)藻株的總脂肪含量和脂肪酸組成進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，海洋微藻的脂肪含量遠(yuǎn)高于海洋大型藻類(lèi)，而且海洋綠藻總脂含量大部分都比較高，為干重的4.52%～34.49%[11]，其中杜氏鹽藻僅次于小球藻，居于第二位，其總脂含量為7.14%～29.91%。一些研究也表明，海洋微藻的總脂含量存在著明顯差異，其中鹽藻的總脂含量最高，最高可達(dá)到干重的28.71%[12]，李荷芳等[4]測(cè)定的一株杜氏鹽藻（Dunaliella sp.）的總脂含量為30.00%。國(guó)內(nèi)外的科學(xué)家利用各種方法篩選出了幾種含油脂量較高的藻種，包括小球藻、鹽藻和角毛藻（Cheatoceros sp.）等，為低成本的生物燃料的生產(chǎn)提供了原料支持[13]。由此可見(jiàn)，在微藻生物質(zhì)能源的研究中，鹽藻是最佳選擇材料之一。

海水鹽度對(duì)海洋生物的影響主要表現(xiàn)在滲透壓和比重上的作用。鹽度對(duì)微藻的影響是多方面的，它不僅影響微藻的生長(zhǎng)，而且影響微藻細(xì)胞內(nèi)脂肪的積累，有關(guān)鹽度對(duì)微藻脂類(lèi)組成的影響只在少數(shù)藻類(lèi)中作過(guò)研究報(bào)道。為了獲得高生物量和高油脂含量的海洋產(chǎn)能微藻，采用單因素試驗(yàn)研究了鹽度對(duì)鹽藻生物量和脂肪積累的影響，以期為海洋微藻生物質(zhì)能源的研究與開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藻種由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所提供，選用經(jīng)培養(yǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)期的單一鹽藻（Dunaliella salina）作為試驗(yàn)藻種。

1.2 方法步驟

1.2.1 培養(yǎng)用水和營(yíng)養(yǎng)鹽 海水取自深圳楊梅坑，經(jīng)過(guò)黑暗沉淀7 d以上，300目篩娟、活性炭和過(guò)濾棉過(guò)濾，煮沸、冷卻，其pH約8.4，鹽度約32.9。營(yíng)養(yǎng)鹽組成：FeC6H5O73.9 mg/L，NaNO317.8 mg/L，NaH2PO44.4 mg/L，CO（NH2）210 mg/L，ZnSO424 μg/L，MnCl2176 μg/L，CuSO410 μg/L，CoCl2·2H2O 12 μg/L，Na2EDTA 4.3 mg/L。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 自然海水中加純凈水或氯化鈉，設(shè)計(jì) 5個(gè)鹽度梯度，即Ⅰ：20、Ⅱ：40、Ⅲ：60、Ⅳ：80和Ⅴ：100（取整數(shù)，下同），每試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)重復(fù)，自然海水鹽度32.9。150 mL藻液，置于磁力攪拌器上培養(yǎng)，攪拌速度約為200 r/min。培養(yǎng)期間，以熒光燈為光源，光照強(qiáng)度2 500～3 000 lx（上海市嘉定學(xué)聯(lián)JD-3照度計(jì)），光照與黑暗比9 h∶15 h，溫度25±3℃，接種密度約為64×104mL藻細(xì)胞，初始pH為8.0。每日顯微觀察和測(cè)吸光值，間隔3～5 d補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)鹽，培養(yǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)末期后收獲并測(cè)定細(xì)胞內(nèi)脂肪含量。

1.2.3 生長(zhǎng)測(cè)定 藻細(xì)胞生長(zhǎng)情況采用XB.K.25.血球記數(shù)板計(jì)數(shù)和紫外分光光度計(jì)（752-P）測(cè)光密度，記OD520，計(jì)數(shù)前先用4%甲醛固定，每瓶測(cè)定兩次，取平均值。相對(duì)生長(zhǎng)率的計(jì)算公式（1）[14]如下：

其中，N0是開(kāi)始時(shí)的細(xì)胞數(shù)，Nt為經(jīng)過(guò)T時(shí)間后的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 藻生物量的采收與測(cè)定 將藻液放在已經(jīng)干燥稱(chēng)量的離心管A（W1）中，5 000 r/min離心15 min（LXJ-JIB低速大容量多管離心機(jī)），去上清液，獲得藻泥。將管A置于烘箱（DGX-9003）內(nèi)45℃烘干至恒重，獲得藻干物質(zhì)，取出管A冷卻至室溫后稱(chēng)重（W2）。（W2-W1）/藻液體積即為微藻的生物量，單位g/L。

研究鹽藻生物量與OD520的線(xiàn)性關(guān)系，設(shè)計(jì)10個(gè)樣品，取生長(zhǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)末期的藻液，其體積從10～1 mL，然后分別加海水 0～9 mL，每個(gè)樣品設(shè) 3個(gè)平行組，分別測(cè)吸光值和生物量。

1.2.5 微藻粗脂肪百分含量的測(cè)定 利用脂肪能溶于脂溶性溶劑這一特性，用脂溶性溶劑無(wú)水乙醚提取藻細(xì)胞內(nèi)的脂肪，蒸發(fā)除去溶劑后測(cè)定脂肪含量的方法。參照陳昱[15]脂肪提取的方法并做某些改進(jìn)：取3 mL培養(yǎng)液于稱(chēng)量已經(jīng)干燥的離心管A（W1），5 000 r/min 離心 5 min（LXJ-JIB 低速大容量多管離心機(jī)），去除上清液。將管A置于烘箱（DGX-9003）內(nèi)45℃干燥至恒重，取出管A冷卻至室溫?fù)v碎成藻粉后稱(chēng)重（W2）。往離心管中注入約2 mL的無(wú)水乙醚，浸泡過(guò)夜后振蕩，抽提2 h，5 000 r/min離心5 min（LXJ-JIB低速大容量多管離心機(jī)），將上清液轉(zhuǎn)移至已稱(chēng)量（W3）的干凈離心管B中。風(fēng)干管B內(nèi)的乙醚，將其置烘箱（DGX-9003）內(nèi)45℃干燥至恒重，取出管B冷卻至室溫后稱(chēng)重（W4）。粗脂類(lèi)（%）=（W4-W3）/（W2-W1）×100，即為微藻粗脂肪含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽藻生物量與吸光值的線(xiàn)性關(guān)系

生物量是影響微藻能源產(chǎn)業(yè)化成本的關(guān)鍵因素之一，為了能夠快速而準(zhǔn)確地測(cè)定生物量的大小，將藻液稀釋一定的倍數(shù)，共10個(gè)樣品，各設(shè)3個(gè)重復(fù)組，分別測(cè)定其吸光值和生物量，取其平均數(shù)（和）作圖（圖1），得出鹽藻生物量與其吸光值的線(xiàn)性關(guān)系。

圖1 鹽藻生物量與吸光值的線(xiàn)性關(guān)系

圖1所示鹽藻生物量與吸光值線(xiàn)性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2大于0.9，說(shuō)明在此吸光值范圍內(nèi)，鹽藻生物量和吸光值的相關(guān)性良好，鹽藻生物量和吸光值的線(xiàn)性關(guān)系如公式（2）。

其中，Y表示鹽藻生物量，單位g/L，X表示在520 nm波長(zhǎng)下的吸光值OD520。

2.2 鹽度對(duì)鹽藻生物量的影響

根據(jù)上述試驗(yàn)方法培養(yǎng)鹽藻，分別測(cè)定指數(shù)生長(zhǎng)末期的生物量，應(yīng)用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件作圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。如圖2所示，在收獲時(shí)期（指數(shù)生長(zhǎng)末期）不同鹽度對(duì)鹽藻生物量的影響，從圖可以看出，Ⅱ號(hào)試驗(yàn)組，即鹽度40最大生物量大于1 g/L，接近鹽度80的2倍。在鹽度20～40的范圍內(nèi)，鹽藻生物量隨著鹽度的增加而增大，而鹽度在40～80的范圍，又表現(xiàn)出高鹽度不利于鹽藻生物量的積累。

圖2 不同鹽度梯度下收獲鹽藻的生物量

測(cè)定不同鹽度水平時(shí)鹽藻的生物量，然后用Dps數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析和多重比較。結(jié)果表明，鹽度變化對(duì)鹽藻生物量的影響具有顯著作用。在鹽度40時(shí)可以收獲最高的生物量，在鹽度80時(shí)生物量最小，僅為0.60 g/L。經(jīng)Duncan`s新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)多重比較，5個(gè)鹽度水平之間都是差異極顯著。綜合不同鹽度下鹽藻的生物量和多重比較的結(jié)果可以認(rèn)為，鹽度在30～60的范圍鹽藻的生物量高，鹽度過(guò)高或過(guò)低均抑制鹽藻的生物量。

2.3 鹽度對(duì)鹽藻總脂肪含量的影響

圖3表明，鹽藻在鹽度40時(shí)總脂肪含量最高，含脂占干重的33.84%。如果鹽度高于或低于40，它們的總脂肪含量隨鹽度的升高或降低而減少。分析結(jié)果表明，鹽度40與鹽度20、60、80和100的差異極顯著（p<0.01），鹽度60與鹽度80差異顯著（0.01

圖3 不同鹽度梯度下鹽藻的脂肪含量

3 討 論

鹽藻是廣鹽性的單細(xì)胞浮游植物，它對(duì)滲透脅迫的適宜能力強(qiáng)，可以在接近淡水，直至飽和鹽水的環(huán)境中生存。相對(duì)于其它藻類(lèi)，鹽藻是耐鹽性最強(qiáng)的單細(xì)胞藻，它能生長(zhǎng)于海水及咸水湖、鹽湖等高鹽環(huán)境下。有試驗(yàn)結(jié)果顯示，牟氏角毛藻細(xì)胞生長(zhǎng)的適宜鹽度范圍是18.5～23.5，最適宜的鹽度為21.0。低鹽度下藻細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間長(zhǎng)；高鹽度下藻細(xì)胞生長(zhǎng)較快，生長(zhǎng)周期較短[16]。鹽度對(duì)綠色巴夫藻生長(zhǎng)無(wú)影響。鹽度25最適合于等鞭金藻3011的生長(zhǎng)[17]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示在鹽度20～100范圍內(nèi)，鹽藻均能正常生長(zhǎng)，可以收獲比較高的生物量。有研究[18]顯示，在超過(guò)200的高鹽度下鹽藻依舊能生長(zhǎng)良好。由圖2可知，在鹽度40時(shí)，生物量達(dá)到最高值，為1.19 g/L，在鹽度80時(shí)生物量最低，為0.60 g/L。這表明鹽度是影響鹽藻生長(zhǎng)和生物量的最主要因素之一。

鹽度對(duì)微藻總脂肪含量的影響機(jī)理尚未清楚，可能是通過(guò)鹽度的調(diào)節(jié)快速增加或降低細(xì)胞內(nèi)甘油的含量，與外液形成滲透平衡。細(xì)胞內(nèi)可用性物質(zhì)如甘油、硝酸鹽、結(jié)構(gòu)蛋白和自由氨基酸的積累都是對(duì)鹽度適應(yīng)的結(jié)果[19]。大量研究表明，改變培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、光強(qiáng)、溫度、通氣量和生長(zhǎng)期以及在不同的時(shí)期收獲對(duì)微藻的脂肪含量和脂肪酸組成有著顯著影響[20]。除此之外，環(huán)境因子在決定微藻脂類(lèi)的種類(lèi)和數(shù)量方面起著重要作用[21]。有研究顯示兩種金藻分別在鹽度20和鹽度30時(shí)總脂肪含量最高，含脂量分別占干重的26.3%和30.3%。從圖3可以看出，鹽藻的總脂肪含量在鹽度40時(shí)最大，100時(shí)最小，并且當(dāng)鹽度大于40時(shí)，總脂肪含量隨鹽度的增加呈現(xiàn)微略變小的趨勢(shì)。因此，在鹽藻生物質(zhì)能源的研究過(guò)程中，為獲得高的生物量和脂肪含量，應(yīng)該選擇的鹽度的范圍是30～40。

鹽藻作為生物質(zhì)能源的材料，與其生物量和脂肪含量密不可分，因?yàn)橹萍s微藻能源產(chǎn)業(yè)化的主要原因是生產(chǎn)成本，而影響生產(chǎn)成本的關(guān)鍵因素是微藻的生物質(zhì)產(chǎn)量和油脂含量，即要求具備低成本生產(chǎn)大量富油微藻的能力[22]。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鹽藻在鹽度40時(shí)能夠收獲最大的生物量（1.19 g/L）和積累更多的脂肪（33.84%），這稍高于李荷芳[4]測(cè)定的一株杜氏鹽藻（Dunaliella sp.）的總脂肪含量30.00%。此結(jié)果表明，鹽藻作為生物質(zhì)能源有巨大的開(kāi)發(fā)潛力，今后可以大規(guī)模養(yǎng)殖鹽藻，用于生物質(zhì)能源開(kāi)發(fā)利用。

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