真菌Rab蛋白功能的研究進(jìn)展

齊堯堯， 張冬梅， 周 潔， 魯國東

(福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350002)

Rab家族蛋白是小G蛋白R(shí)as超家族最大的亞家族，普遍存在于真核生物中，分子質(zhì)量大多在22-25 ku，在酵母、果蠅、小鼠和人類等各種真核生物中發(fā)揮著各種各樣的功能。近年來，真菌 Rab 族蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究成為小G蛋白研究的熱點(diǎn)。Rab蛋白最早在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中發(fā)現(xiàn)，稱為YPT/SEC蛋白。隨后Touchot et al[1]從大鼠大腦cDNA文庫中克隆到與YPT/SEC功能類似的同源物，并將其命名為Rab。根據(jù)Rab家族成員的同源性和功能相似性，可將Rab家族蛋白分成10個(gè)亞家族，即Rabl、Rab3、Rab4、Rab5、Rab6、Rab8、Rabll、Rab22、Rab27和Rab40[2-4]，其中真菌Rab家族中有Ypt1、Sec4、Ypt3、Ypt5、Ypt6、Ypt7、Ypt10、Ypt11、Ypt4和Ypt8等十幾個(gè)亞家族。細(xì)胞學(xué)定位研究結(jié)果表明，Rab蛋白廣泛分布于胞內(nèi)各個(gè)細(xì)胞器的漿膜內(nèi)側(cè)，同一個(gè)細(xì)胞器可以有多個(gè)Rab蛋白，以維持蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的連續(xù)性和細(xì)胞器膜的完整性，其功能的發(fā)揮依賴于其在細(xì)胞中的定位[5]。真核生物的胞吞作用對(duì)于膜蛋白、膜脂的周轉(zhuǎn)或清除，營養(yǎng)的攝入，膜受體蛋白的調(diào)控，細(xì)胞極性的維持以及抗原遞呈等都具有重要意義。研究表明， Rab家族蛋白是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最為重要的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，在真核生物胞吞過程的泡囊形成和運(yùn)輸中均起著重要的調(diào)節(jié)作用。

1 Rab蛋白的結(jié)構(gòu)

真核生物的Rab蛋白作為一種單體形式的GTP結(jié)合蛋白，大約由200個(gè)氨基酸組成，能夠結(jié)合GTP并將GTP水解。Rab蛋白具有一些共同的結(jié)構(gòu)特征，即由保守的G結(jié)構(gòu)域和高度可變的N端和C端組成。G結(jié)構(gòu)域包含 5 個(gè)α螺旋(A12A5) 、 6 個(gè)β片層(B12B6)和5個(gè)多肽環(huán)(G12G5)，并與Mg2+相連。6個(gè)β片層形成疏水的核，與親水的α螺旋和多肽環(huán)連接。5個(gè)多肽環(huán)中共有序列元件與 Mg2+、 GTP/ GDP發(fā)生相互作用。在G結(jié)構(gòu)域中存在2個(gè)分子開關(guān)(switch I和switch II)，分別位于G2和G4-a2-G5，是Rab蛋白與其調(diào)控因子相互作用的位點(diǎn)[6]。研究表明，不同 Rab蛋白的分子開關(guān)區(qū)域相似，不僅結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相同而且分子開關(guān) II 的構(gòu)象保守[7-8]。

Rab 蛋白的 N 端和 C端在長度和序列上是高度可變的。Rab 蛋白 C 端均有 C、CC、 CXC或 CXXX模體(motif)，該模體是一種膜定位信號(hào)。當(dāng)模體中的半胱氨酸異戊二烯化修飾后，Rab蛋白即通過 C端與膜相連。N端的作用可能是參與指導(dǎo)C端半胱氨酸進(jìn)行異戊二烯化修飾。對(duì)Rab蛋白突變體及嵌合體的研究表明，分子開關(guān) I和分子開關(guān) II、高度可變的N 端和 C端是 Rab 蛋白重要功能的決定者。

2 真菌中Rab蛋白的種類

最新的人類基因組測(cè)序結(jié)果表明，人類至少有70個(gè)Rab蛋白[9]，廣泛存在于各染色體。在釀酒酵母中，有11個(gè)Rabs/Ypts；秀麗短桿線蟲有29個(gè)Rabs；黑腹果蠅中有29個(gè)Rabs；擬南芥中有57個(gè)Rabs。就某個(gè)Rab而言，在哺乳動(dòng)物和酵母中功能是保守的[3]。

真核生物不同物種的細(xì)胞因物種的進(jìn)化位置不同而表現(xiàn)某種程度的特化及專一性。Rab蛋白就是具有組織特異性和細(xì)胞器特異性的小G蛋白。這種定位特異性，甚至被認(rèn)為是某種細(xì)胞器的標(biāo)記。真菌中的一部分Rab蛋白和相應(yīng)的真核祖先的大小相似，甚至略小。這說明營腐生生活的真菌，盡管由于菌絲多細(xì)胞性需要高強(qiáng)度的分泌活動(dòng)，但是并沒有進(jìn)化出一套特殊的調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制。真菌中Rab/Ypt蛋白和其它與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白家族一樣，數(shù)目較少[10](圖1)，而且其數(shù)量不是隨基因組的增加而相應(yīng)增加。表明在Rab蛋白中，真菌的多細(xì)胞性和細(xì)胞多樣性遵循的進(jìn)化途徑與植物和動(dòng)物不同。

圖1中所列的是人和植物的常見病原真菌，26種真菌中有24種Rab家族成員的數(shù)目穩(wěn)定在8-12個(gè)，而它們基因組大小差異很大，基因數(shù)2000-17000個(gè)。對(duì)釀酒酵母(S.cerevisiae)等真菌的研究表明，真菌Rab蛋白家族包含有Ypt1、Sec4、Ypt3、Ypt5、Ypt6、Ypt7、Ypt10、Ypt11、Ypt4、Ypt8、A、B和C等十幾個(gè)亞家族。

稻瘟病菌基因組共有11 個(gè)假定的Rab 蛋白成員， 這些蛋白均含Ras超家族典型的結(jié)構(gòu)域， 但具有可以區(qū)別于Cdc42 等Rho 家族小GTP 酶的特征， 部分Rab 成員表現(xiàn)出組織與時(shí)空表達(dá)的特異性。 進(jìn)一步系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明： 稻瘟病菌、白色念珠菌、粗糙脈孢菌等23 種真菌Rab 蛋白在進(jìn)化樹上聚成8 個(gè)分枝；Rab 蛋白的分化可能早于真菌種類的分化[11]。

A表示常見的真菌進(jìn)化關(guān)系,B中每一欄表示1個(gè)Rab亞家族,C分別表示細(xì)胞分裂方式、分類和生活類型。 圖1 真菌中Rab家族蛋白 Figure 1 The Rab protein family in fungi

3 真菌中Rab蛋白的功能

Ypt1、Sec4、Ypt3、Ypt5、Ypt6 和Ypt7亞家族為真菌中最常見的Rab家族，其定位[10]如圖2所示。從圖2可看出：Ypt1定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和順面高爾基體膜囊，在分泌途徑的早期發(fā)揮作用，介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸；Ypt3及其同功蛋白R(shí)ab11參與深層次的胞吞作用[10]；Ypt5介導(dǎo)高爾基體-內(nèi)涵體和質(zhì)膜-內(nèi)涵體運(yùn)輸。Ypt6參與高爾基體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體內(nèi)的運(yùn)輸；Ypt7介導(dǎo)膜泡的融合；Sec4介導(dǎo)來源于順面高爾基體網(wǎng)狀膜囊的囊泡進(jìn)入芽體，意味著其同功蛋白R(shí)ab8介導(dǎo)極性運(yùn)輸結(jié)構(gòu)的形成[3，9]。

圖2 真菌Rab蛋白的定位和功能Figure 2 The localization and function of the common set of fungi Rab protein

3.1 酵母Rab蛋白

Rab 蛋白最早由Novick et al[12]在釀酒酵母分泌系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)，它們是許多細(xì)胞正常分泌所必需的，并以SEC 系列命名(如SEC1 等) 。隨后，Gallwitz et al[13]發(fā)現(xiàn)了YPT1 基因。釀酒酵母SEC4 基因和YPT1基因都參與細(xì)胞分泌活動(dòng)。YPT1、SEC4和YPT7在胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)牟煌A段發(fā)揮作用[14]。酵母中的 Rab蛋白稱為 Ypt蛋白 (Yeast protein transport) 。在目前已報(bào)道的基因組序列中，裂殖酵母 (S.pombe) 含有最少數(shù)量的 Rab蛋白基因，僅編碼 7個(gè) Rab蛋白，釀酒酵母Vam4/Ypt7p在同型囊泡融合過程中發(fā)揮著重要作用。釀酒酵母編碼 11個(gè) Rab蛋白， 其中Ypt1、Ypt31、Ypt32和Sec4是細(xì)胞生存所必需的，它們參與細(xì)胞的胞外分泌。有5種蛋白Ypt51、 Ypt52、Ypt53、Ypt6和Ypt7參與細(xì)胞的內(nèi)吞過程，為非生存必需蛋白。其中Ypt6是內(nèi)涵體到高爾基體之間膜蛋白循環(huán)所必需的[14]，Ypt10和Ypt11的功能目前還不清楚[15]。

酵母同型囊泡融合停泊需要Sec18p (NSF)引發(fā)。多亞基蛋白復(fù)合體Vam2/6p和位于單個(gè)囊泡膜上的SNAREs(SNAP receptors)，即v-SNARE的結(jié)合需要Ypt7p參與。Vam2/6p首先結(jié)合小G蛋白Ypt7p引發(fā)囊泡之間的多重聯(lián)系；v-SNARE 復(fù)合體中Rab/Ypt效應(yīng)子經(jīng)NSF/Sec18p驅(qū)動(dòng)，直接與Rab/Ypt蛋白結(jié)合，進(jìn)而停泊[16]。

3.2 絲狀真菌的Rab蛋白

構(gòu)巢曲霉中Vam4/Ypt7p類似物AvaA的缺陷，引起空泡片段化撕裂，說明AvaA在囊泡形成過程中行使功能[17]。黑曲霉SEC4類似物SrgA的突變體，菌絲生長速度加倍，在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上蛋白分泌顯著減少，說明SrgA雖具有生理功能，但不是黑曲霉生長所必需的[18]。

關(guān)于Rab蛋白及其效應(yīng)因子在植物病原真菌中的作用已有一些研究。對(duì)Colletotrichumlindemuthianum的研究發(fā)現(xiàn)，Rab蛋白通過參與胞內(nèi)分泌泡囊的運(yùn)輸、將相關(guān)蛋白運(yùn)送至胞外以及分化侵染結(jié)構(gòu)等一系列過程來調(diào)控該菌的致病性；而對(duì)Ustilagomaydis的研究發(fā)現(xiàn)，SNARE蛋白[19]YUP1與Rab5共定位于早期內(nèi)涵體，其介導(dǎo)的胞吞作用對(duì)該菌致病的早期過程是至關(guān)重要的。

稻瘟病菌是水稻的重要病原真菌，也是絲狀真菌研究的模式生物。研究表明，至少有2個(gè)信號(hào)途徑及大量的基因參與調(diào)控稻瘟病菌的侵染致病過程。一是依賴于cAMP的蛋白激酶途徑，二是MAP蛋白激酶級(jí)聯(lián)機(jī)制。稻瘟病菌的侵染過程經(jīng)歷了分生孢子萌發(fā)、附著胞分化、侵入栓形成以及侵染生長等過程，涉及到復(fù)雜的蛋白修飾、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的膜融合等生理活動(dòng)。Fischer-Parton et al[20]借助熒光染料FM4-64，在顯微鏡下觀察到包括稻瘟病菌在內(nèi)的9種絲狀真菌菌絲中的胞吞現(xiàn)象。Atkinson et al[21]對(duì)稻瘟病菌活細(xì)胞顯微觀察發(fā)現(xiàn)，胞吞作用貫穿于分生孢子萌發(fā)至侵染水稻的早期過程，暗示著胞吞作用與稻瘟病菌致病性存在相關(guān)性。因此，Rab家族蛋白介導(dǎo)的胞吞作用在稻瘟病菌侵染致病過程中可能發(fā)揮著重要作用。

4 展望

Rab家族蛋白是一類可能具有重要生物學(xué)功能的蛋白，隨著對(duì)互作蛋白研究的不斷深入，新的Rab蛋白及其效應(yīng)因子不斷被發(fā)現(xiàn)。Rab家族成員具有不同的功能，且不同的成員遍及細(xì)胞內(nèi)各類細(xì)胞器及運(yùn)輸囊泡，以調(diào)節(jié)囊泡特定的運(yùn)輸途徑。目前國內(nèi)主要集中于對(duì)人和水稻中Rab蛋白基因的克隆、蛋白表達(dá)及功能的研究。深入了解真菌中Rab家族蛋白的功能，將有利于進(jìn)一步揭示稻瘟病菌等植物病原真菌的致病機(jī)制，對(duì)于制定合理的防治策略具有重要的意義。

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