Oct4在多種人腺癌組織中表達(dá)水平的研究

張金龍 ，王海娟 ，路 中 ，劉 健 ，林 晨 ，錢海利 *，李貴新 *

1.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261053；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021

Oct4在多種人腺癌組織中表達(dá)水平的研究

張金龍1，王海娟2，路 中1，劉 健2，林 晨2，錢海利2*，李貴新1*

1.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261053；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021

目的：研究5種人腺癌中Oct4的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探索其在腫瘤發(fā)生中的機(jī)制提供基礎(chǔ)。方法：應(yīng)用乳腺癌、胃癌、胰腺癌、腸癌、子宮內(nèi)膜癌5種腺癌的組織芯片，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色研究Oct4蛋白在組織中的表達(dá)情況，并與癌旁正常組織進(jìn)行比較。結(jié)果：Oct4在5種腺癌腫瘤組織內(nèi)均有表達(dá)，胃癌組織內(nèi)Oct4的表達(dá)高于癌旁正常組織（P<0.05），其他腺癌組織中Oct4的表達(dá)與癌旁組織差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在乳腺癌和腸癌中，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的腫瘤組織中Oct4表達(dá)高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的腫瘤組織（P<0.05），而在胃癌、胰腺癌及子宮內(nèi)膜癌患者中未觀察到這種差異；5種腺癌的腫瘤組織內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)Oct4的表達(dá)與臨床分期有關(guān)。Oct4在癌旁正常組織中（子宮內(nèi)膜癌除外）主要定位于細(xì)胞漿，而在腺癌組織中既表達(dá)于細(xì)胞核，也表達(dá)于細(xì)胞漿。結(jié)論：Oct4的表達(dá)可能是腫瘤發(fā)生過(guò)程中的早期事件，不同腺癌組織中Oct4的表達(dá)情況不完全相同，Oct4的核/漿表達(dá)模式可能與其在腫瘤發(fā)生中的作用有關(guān)。

Oct4；腺癌；組織芯片；免疫組織化學(xué)

Oct4（也稱為 Oct3/4、POU5F1、OTF3、OTF4）是 POU 家族的成員，與細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化有關(guān)，通常認(rèn)為其表達(dá)與胚性細(xì)胞的多能性有關(guān)，是細(xì)胞干性狀態(tài)的標(biāo)志[1]。腫瘤細(xì)胞是處于不同去分化程度的異質(zhì)性細(xì)胞群。新近的研究表明，腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展是由于其中存在一小部分具有不斷自我更新、分化和高度致瘤能力的細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞。這部分腫瘤干細(xì)胞是腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥的根源。因此，腫瘤的干性狀態(tài)決定著腫瘤治療的敏感性和最終結(jié)局。Oct4作為多功能因子在腫瘤和干細(xì)胞的生物學(xué)方面具有潛在致癌性，也是細(xì)胞自我更新及分化的調(diào)節(jié)器[2]，并且認(rèn)為Oct4在維持腫瘤干細(xì)胞的性質(zhì)及抵抗性方面具有重要的作用[3]。因此，本文通過(guò)研究5種腺癌包括乳腺癌、胃癌、胰腺癌、腸癌、子宮內(nèi)膜癌中Oct4的表達(dá)情況，探討Oct4在腺癌發(fā)生過(guò)程中的潛在作用，并為未來(lái)的腫瘤干細(xì)胞機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

腺癌組織芯片臨床病理資料：腺癌組織芯片由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科呂寧教授提供。芯片共包含150例腺癌患者的組織樣本，就診時(shí)間為2002～2003年。乳腺癌、胃癌、胰腺癌、腸癌、子宮內(nèi)膜癌各30例（芯片處理過(guò)程中有個(gè)別樣本脫落現(xiàn)象，以獲得實(shí)際結(jié)果的樣本數(shù)為準(zhǔn)），每種系統(tǒng)腫瘤均包括5例癌旁組織。

1.2 試劑

兔抗人Oct4多克隆抗體（abcam，ab19857），第二代通用型二步法檢測(cè)系統(tǒng)（PV9000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色步驟 采用免疫組織化學(xué)通用型二步法。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，山羊IgG按照5μg/m l稀釋代替一抗作為同型對(duì)照，精原細(xì)胞瘤組織作為陽(yáng)性對(duì)照。組織芯片常規(guī)脫蠟至水，EDTA抗原修復(fù)液（pH=8.0）行熱修復(fù)，3%H2O2孵育30min，山羊血清封閉10 min。滴加Oct4（1∶250）4℃過(guò)夜，滴加增強(qiáng)劑室溫孵育 25min，滴加二抗室溫孵育25 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水，封片。鏡檢。

1.3.2 免疫組織化學(xué)評(píng)分 Oct4在細(xì)胞核、細(xì)胞漿中均有表達(dá)，分別評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如文獻(xiàn)[4]所述，按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～25%為1分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26%～50%為2分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞75%為4分。按染色強(qiáng)度分為：基本未著色、著色與背景相似者為0分；著色淺略高于背景者為1分；中度著色、明顯高于背景者為2分；強(qiáng)染、呈深棕色者為3分。對(duì)每一組織點(diǎn)來(lái)說(shuō)，用陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)評(píng)分與染色強(qiáng)度的乘積為最終評(píng)分，0～4 分為弱表達(dá)，5～8 分為中等表達(dá)，9～12 分為強(qiáng)表達(dá)。綜合染色強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分級(jí)，取表達(dá)最強(qiáng)的部分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，差異采用非參數(shù)檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用秩相關(guān)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Oct4在不同腫瘤組織中的表達(dá)情況（圖1）

Oct4在乳腺癌腫瘤組織內(nèi)有表達(dá)，而癌旁組織未見(jiàn)表達(dá)。胃癌的癌旁組織的表達(dá)高于腫瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），腸癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌腫瘤組織與癌旁組織Oct4的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 Oct4的表達(dá)與腫瘤臨床分期的關(guān)系（表1）

5 種腺癌的腫瘤組織內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)Oct4的表達(dá)與臨床分期相關(guān)，并且早期（Ⅰ～Ⅱ期）與進(jìn)展期（Ⅲ期）患者Oct4的表達(dá)無(wú)差異。

2.3 Oct4的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系（表1）

5 種腺癌的腫瘤組織內(nèi)，乳腺癌、腸癌未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Oct4的表達(dá)高，Oct4的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無(wú)相關(guān)性。胃癌、胰腺癌及子宮內(nèi)膜癌患者Oct4的表達(dá)無(wú)差異。

2.4 Oct4在細(xì)胞核、細(xì)胞漿的表達(dá)情況（表2、圖2）

Oct4在不同腫瘤中的核/漿表達(dá)模式不完全相同。乳腺癌患者腫瘤組織細(xì)胞核表達(dá)而細(xì)胞漿不表達(dá)者3例，占10.00%（3/30），細(xì)胞漿表達(dá)而細(xì)胞核不表達(dá)者2例，占6.67%（2/30），癌旁組織不表達(dá)。胰腺癌患者腫瘤組織及癌旁組織細(xì)胞漿表達(dá)明顯高于細(xì)胞核 （P＜0.05）。胃癌患者腫瘤組織內(nèi)，細(xì)胞核、細(xì)胞漿均表達(dá)者11例，占36.67%（11/30），癌旁組織僅表達(dá)于細(xì)胞漿，且癌旁組織表達(dá)高于腫瘤組織。腸癌患者腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞漿、細(xì)胞核均表達(dá)者18例，占60.00%（18/30），而癌旁組織中腺管組織內(nèi)細(xì)胞核、細(xì)胞漿均有表達(dá)，間質(zhì)組織中僅細(xì)胞核表達(dá)。子宮內(nèi)膜患者癌腫瘤組織細(xì)胞核、細(xì)胞漿均有表達(dá)者21例，占70.00%（21/30），癌旁組織只在細(xì)胞核表達(dá)，細(xì)胞漿不表達(dá)。

表1 Oct4的表達(dá)與5種腺癌的臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The correlation between Oct4 expression and the clinicaland pathologicalparam eters in 5 types of adenocarcinoma

表2 Oct4在5種腺癌腫瘤組織及癌旁組織細(xì)胞核、細(xì)胞漿表達(dá)情況Tab.2 The expression of Oct4 in the nucleus and cytoplasm of 5 types adenocarcinoma and paratum oral tissues

3 討論

Oct4是多潛能性的標(biāo)志，表達(dá)于人類胚胎干細(xì)胞[5]，在分化組織內(nèi)其表達(dá)量下降[6]。Oct4是少數(shù)能夠使成體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 （induced pluripotent stem cells，iPS）的細(xì)胞因子[7]。Kim[8]甚至用Oct4單個(gè)基因就能夠從成年小鼠神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)出多能干細(xì)胞。Hochedlinger等[1]的研究顯示Oct4本身就可能引起上皮異常增生，在成年小鼠體內(nèi)，誘導(dǎo)Oct4的過(guò)表達(dá)可以抑制細(xì)胞分化，進(jìn)而引起腸道發(fā)育異常。進(jìn)一步研究顯示胰腺細(xì)胞分化過(guò)程中檢測(cè)到Oct4的表達(dá)，當(dāng)胰腺干細(xì)胞分化為內(nèi)分泌細(xì)胞時(shí)則檢測(cè)不到Oct4的表達(dá)。

Oct4在腫瘤形成過(guò)程中也發(fā)揮一定的作用。不僅在生殖細(xì)胞瘤中檢測(cè)到Oct4的表達(dá)[9]，在膀胱癌[10]、肺癌[11]、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[12]、前列腺癌[13]及許多腫瘤細(xì)胞株內(nèi)均檢測(cè)到其表達(dá)。在用Oct4誘導(dǎo)iPS細(xì)胞時(shí)會(huì)有相當(dāng)?shù)臋C(jī)會(huì)產(chǎn)生有致瘤能力的癌變細(xì)胞。

為了明確Oct4在腫瘤、尤其是腺癌發(fā)生中的作用，我們首先對(duì)多種腺癌中Oct4的表達(dá)進(jìn)行了免疫組織化學(xué)研究。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Oct4在多種腺癌組織中均有不同程度的表達(dá)，并且在部分腺癌的癌旁組織內(nèi)檢測(cè)到Oct4的表達(dá)。提示其表達(dá)可能在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中起了重要作用。有研究顯示[14]，Oct4陽(yáng)性腫瘤患者其死亡率高于陰性患者。

而且，我們未發(fā)現(xiàn)Oct4的表達(dá)與臨床分期之間的相關(guān)性，這與Wang等[15]的結(jié)果一致，但是他們發(fā)現(xiàn)Oct4與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)有明顯的相關(guān)性，可能與其去分化有關(guān)。同樣我們也未發(fā)現(xiàn)Oct4與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。提示Oct4可能只是腫瘤發(fā)生的一個(gè)早期事件，一旦啟動(dòng)腫瘤發(fā)生以后會(huì)有更多的因素參與腫瘤的進(jìn)展。

人類Oct4基因有3種剪切體[16]：Oct4A、Oct4B及Oct4B1。Oct4A主要定位于胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞核，維持細(xì)胞的自我更新及分化潛能。在生殖細(xì)胞瘤及胚胎性腫瘤中均檢測(cè)到Oct4A表達(dá)的上調(diào)，提示其可能參與了腫瘤的形成[9,17]，而在正常體細(xì)胞中Oct4A只有較低表達(dá)，在其相應(yīng)的腫瘤組織內(nèi)其表達(dá)量會(huì)明顯增加[17]。Karoubi等[18]在肺腺癌中發(fā)現(xiàn)Oct4A在細(xì)胞核、細(xì)胞漿均有表達(dá)，并且腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)明顯高于正常組織。Oct4B則定位于實(shí)體瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿，不具有自我更新能力[19]。Oct4B只在細(xì)胞漿表達(dá)，并且腫瘤組織與正常組織的表達(dá)無(wú)差異。Oct4B1不僅表達(dá)于實(shí)體瘤細(xì)胞，也高表達(dá)于ES細(xì)胞，但是在分化的細(xì)胞中其表達(dá)迅速下降[16]。Asadi等[20]在胃腺癌中檢測(cè)到Oct4B1的高表達(dá)，其作為抗凋亡因子，與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。

我們也發(fā)現(xiàn)Oct4在5種腺癌患者腫瘤組織的細(xì)胞核、細(xì)胞漿中均有表達(dá)。乳腺癌患者的癌旁組織不表達(dá)，子宮內(nèi)膜癌患者癌旁組織Oct4只表達(dá)于細(xì)胞核而細(xì)胞漿不表達(dá)，腸癌患者癌旁組織中腺管組織內(nèi)細(xì)胞核、細(xì)胞漿均有表達(dá)，間質(zhì)組織中僅表達(dá)于細(xì)胞核。胃癌患者癌旁組織主要表達(dá)于細(xì)胞漿，細(xì)胞核有少量表達(dá)。推測(cè)Oct4可能首先在細(xì)胞核表達(dá)，然后隨著細(xì)胞的去分化細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展。

本研究首次檢測(cè)Oct4在多種腺癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)不同腺癌組織中Oct4的表達(dá)情況不完全相同，并且Oct4在細(xì)胞核、細(xì)胞漿的定位表達(dá)情況也有差異。但由于我們所收集患者例數(shù)有限，及患者臨床資料不夠完整，所以O(shè)ct4作為腺癌診斷及治療指標(biāo)的價(jià)值，尚需更深入的研究證實(shí)。根據(jù)其不同剪切體表達(dá)部位及功能的不同，也有待進(jìn)一步的研究，明確其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，篩選出可靠的用于臨床篩查、診斷及治療的特異性分子標(biāo)志，為腫瘤的早期診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)提供新的思路。

[1]Hochedlinger K,Yamada Y,Beard C,et al.Ectopic expression of OCT-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues[J].Cell,2005,121(3):465-477.

[2]Gidekel S,Pizov G,Bergman Y,et al.Oct-3/4 is a dose-dependent oncogenic fate determinant[J].Cancer Cell,2003,4:361-370.

[3]Chen YC,Hsu HS,Chen YW,etal.Oct-4 expressionmaintained cancer stem-like properties in lung cancer-derived CD133-positive cells[J].PLoSONE,2008,3(7):e2637.

[4]馬曉艷,張蕾,高冬玲,等.MTA1與E-cadherin在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床,2009,22(2):103-105.

[6]Okuda T,Tagawa K,Qi ML,et al.Oct-3/4 repression accelerates differentiation ofneural progenitor cells in vitro and in vivo[J].Mol Brain Res,2004,132(1):18-30.

[7]Zaehres H,Scholer HR.Induction of pluripotency:from mouse to human[J].Cell,2007,131(5):834-835.

[8]Kim JB,Sebastiano V,Wu GM,et al.Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells[J].Cell,2009,136(3):663-676.

[9]Looijenga LH,Stoop H,de Leeuw HP,et al.POU5F1(OCT3/4)identifies cellswith pluripotent potential in human germ cell tumors[J].Cancer Res,2003,63(9):2244-2250.

[10]Atlasi Y,Mowla SJ,Ziaee SA,et al.OCT-4,an embryonic stem cell marker,is highly expressed in bladder cancer [J].Int J Cancer,2007,120(7):1598-1602.

[11]Karoubi G,Gugger M,Schmid R,et al.OCT4 expression in human non-small cell lung cancer:implications for therapeutic intervention[J].Interact Cardiovasc Thorac Surg,2009,8(4):393-397.

[12]Seigel GM,Hackam AS,Ganguly A,et al.Human embryonic and neuronal stem cell markers in retinoblastoma [J].Mol Vis,2007,13:823-832.

[13]Sotomayor P,Godoy A,Smith GJ,et al.Oct4A is expressed by a subpopulation of prostate neuroendocrine cells[J].Prostate,2009,69(4):401-410.

[14]Zhang XY,Dong QG,Huang JS,et al.The expression of stem cellrelated indicators as a prognostic factor in human lung adenocarcinoma[J].JSurg Oncol,2010,102(7):856-862.

[15]Wang QH,He W,Lu C,et al.Oct3/4 and Sox2 are significantly associated with an unfavorable clinical outcome in human esophageal squamous cell carcinoma[J].Anticancer Res,2009,29(4):1233-1241.

[16]Atlasi Y,Mowla SJ,Ziaee SA,et al.OCT4 spliced variants are differentially expressed in human pluripotent and nonpluripotent cells[J].Stem Cells,2008,26(12):3068-3074.

[17]Monsef N,Soller M,Isaksson M,et al.The expression of pluripotency marker Oct 3/4 in prostate cancer and benign prostate hyperplasia[J].Prostate,2009,69(9):909-916.

[18]Karoubi G,Cortes-Dericks L,Gugger M,et al.A typical expression and distribution of embryonic stem cellmarker,OCT4,in human lung adenocarcinoma[J].JSurg Oncol,2010,102(6):689-698.

[19]Cauffman G,Liebaers I,Van Steirteghem A,et al.POU5F1 isoforms show different expression patterns in human embryonic stem cells and preimplantation embryos[J].Stem Cells,2006,24(12):2685-2691.

[20]Asadi MH,Mowla SJ,Fathi F,et al.OCT4B1,a novel spliced variant of OCT4,is highly expressed in gastric cancer and acts as an antiapoptotic factor[J].Int JCancer,2010,Epub ahead of print.

Research the expression of Oct4 in multiple adenocarcinoma

ZHANGJinlong1,WANGHaijuan2,LUZhong1,LIUJian2,LINChen2,QIANHaili2*,LIGuixin1*

1.Weifang Medical University,Weifang 261053,China;2.State Key Laboratory of Molecular Oncology,Cancer Institute/Cancer Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100021,China

Objective:To study the expression of Oct4 in adenocarcinomas from 5 tissue origins and provide insights to the Oct4-related mechanism of carcinogensis.Methods:Immuno-histochemistry staining was adopted to study the expression of Oct4 protein in adenocarcinoma tissue array containing adenocarcinoma and paratumoral samples of 5 tissue origins.Results:Oct4 was expressed in all 5 adenocarcinomas.Oct4 was significantly differently expressed in gastric-derived adenocarcinoma and paratumoral tissue (P<0.05),but not other origins.Breast and intestinal adenocarcinomaswithout lymph nodemetastasis had stronger Oct4 expression than thosewith lymph nodemetastasis （P<0.05）.However,therewas no difference of Oct4 level in gastric cancer,pancreatic cancer and endometrial cancer,no association of Oct4 expression with clinical stage was observed.Except for in endometrium tissue,Oct4 wasmainly located in cytoplasm in normal tissue,but in nucleus and cytoplasm in tumor tissue.Conclusion:The expression of Oct4may be an early event during tumorigenesis;Oct4 was expressed in different patterns in various tissues and their counterpart adenocarcinoma.The distribution of Oct4 in nuclear or cytoplasm may present its physiological or pathological function during tumorigenesis.

Oct4;Adenocarcinoma;Tissue array;Immuno-histochemistry

R730.2

A

1674-4721（2011）03（b）-017－04

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（30973447）。

張金龍（1984-），男，山東沂水人；濰坊醫(yī)學(xué)院2008級(jí)在讀碩士研究生；研究方向：結(jié)腸癌干細(xì)胞。

*通訊作者

2011-01-13）