基于殼聚糖-辣根過氧化物酶-多壁碳納米管修飾電極的直接電化學(xué)研究

姚 慧， 董 元， 劉海杰， 鐘亞婷

(沈陽(yáng)化工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110142)

電化學(xué)生物傳感器具有靈敏度高，易微型化，能在復(fù)雜體系樣品中進(jìn)行檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，并且所需的儀器簡(jiǎn)單、便宜，在商業(yè)化應(yīng)用領(lǐng)域中也處于重要地位，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健、食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域［1］.基于氧化還原蛋白質(zhì)在電極上直接電子轉(zhuǎn)移的第三代電化學(xué)生物傳感器是目前電化學(xué)生物傳感器研究的新方向，它不但在了解生物氧化還原過程的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)、探索生命體內(nèi)生理作用機(jī)制等理論研究方面具有重要意義，在選擇性、靈敏度和測(cè)量范圍等性能方面也有新的突破［2］.

自從1991年碳納米管出現(xiàn)以來，因其獨(dú)特的電子學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)被人們廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域［3－5］，特別是在電分析化學(xué)領(lǐng)域，其研究非常廣泛［6－8］.在生物電化學(xué)領(lǐng)域，碳納米管作為固定生物分子的載體更是倍受人們的關(guān)注，這是因?yàn)槎啾谔技{米管能支持快速的電子遷移，且可直接固定在基底電極上［9－11］.在生物電化學(xué)的研究中，已經(jīng)有將生物分子酶共價(jià)固定在碳納米管載體上的報(bào)道［7，12－13］.辣根過氧化物酶(HRP)在室溫下很穩(wěn)定，且容易得到，價(jià)格便宜，是商品化較早、應(yīng)用較為廣泛的一種酶制劑.隨著酶固定化技術(shù)的發(fā)展和新檢測(cè)方法的應(yīng)用，HRP修飾電極的檢測(cè)性能不斷提高，應(yīng)用領(lǐng)域也不斷拓展，HRP已被廣泛地應(yīng)用于酶聯(lián)免疫分析和生物傳感器的構(gòu)筑［14－15］.

以往應(yīng)用殼聚糖(CHIT)和多壁碳納米管(MWNTs)包埋HRP時(shí)，采取簡(jiǎn)單混合的方法，制備的生物電化學(xué)傳感器取得了相應(yīng)的電化學(xué)響應(yīng)［16－17］;但是由于修飾膜中的物質(zhì)是依靠物理吸附結(jié)合起來的，因此修飾膜的穩(wěn)定性和固定化酶的性能都有待提高.本文制備了一種復(fù)合物CHIT-MWNTs，并用該復(fù)合物包埋HRP，改進(jìn)了修飾膜的性能，取得了良好的效果.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660C型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng);玻碳電極(內(nèi)徑3 mm)或修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲電極為輔助電極;超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司).

辣根過氧化物酶(HRP)(Sigma公司)，殼聚糖(CHIT)(脫乙酰度為92%)，多壁碳納米管(MWNTs)(北京納辰科技發(fā)展有限公司)，過氧化氫(體積分?jǐn)?shù)30%).其他試劑均為分析純.實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.

1.2 修飾復(fù)合材料的制備

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CHIT溶液用0.05 mol·L－1的乙酸在加熱條件下配制.10 g·L－1的HRP溶液保存于4℃冰箱中.

根據(jù)文獻(xiàn)［14］，將10 mg的MWNTs分散在10 mL的CHIT溶液中，超聲10 min后攪拌2 h，然后逐滴加入稀氨水至分散液中pH值為8.0左右，再將混合液加熱到60℃，加入10 μL戊二醛來交聯(lián)MWNTs表面沉積的CHIT.最后離心收集CHIT-MWNTs產(chǎn)物，用稀醋酸沖洗掉吸附及未交聯(lián)的殼聚糖.將得到的CHIT-MWNTs納米復(fù)合材料重新溶解于稀醋酸溶液中，備用.

1.3 電極的制備

用砂紙將玻碳電極(GCE)表面打磨光滑，用γ-Al2O3粉末打磨至鏡面，依次用體積比為1∶1硝酸，丙酮，二次蒸餾水各超聲3 min，洗去可能的污染物.用氮?dú)獯蹈蓚溆?

將0.1 mL的CHIT-WMNTs溶液、0.2 mL的殼聚糖溶液和0.1 mL的辣根過氧化物酶溶液充分混合，加入5 μL交聯(lián)劑戊二醛混合.取5 μL此混合液滴在玻碳電極表面，涂勻，放置在4℃的冰箱中24 h使干燥，得到CHIT-MWNTs-HPR/ GCE.對(duì)照實(shí)驗(yàn)中的 CHIT-HRP/GCE、CHIT/ GCE、CHIT-MWNTs/GCE的制作程序與CHITMWNTs-HPR/GCE相似.

電極未使用時(shí)放在4℃冰箱中保存.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)在一個(gè)裝有10 mL磷酸緩沖溶液(PBS)的小燒杯中進(jìn)行，準(zhǔn)確移取10 mL緩沖溶液至小燒杯中，用CHI660C型電化學(xué)工作站在－0.8 V～0.2 V點(diǎn)位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描.掃描前向PBS中通氮?dú)?0 min以排除氧氣的干擾，所有實(shí)驗(yàn)操作均在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 CHIT-MWNTs納米復(fù)合材料的電鏡表征

殼聚糖表面修飾碳納米管克服了碳納米管簡(jiǎn)單超聲分散在殼聚糖溶液中成膜不均勻的劣勢(shì).圖1為CHIT-MWNTs納米復(fù)合材料的SEM圖像.可以看到:CHIT-MWNTs復(fù)合物呈單一的納米管狀或小的束狀，均勻地分散在GCE表面，形成一種特殊的三維結(jié)構(gòu).殼聚糖良好的生物相容性得到保留，同時(shí)，由于得到的每一根復(fù)合納米管能被充分和容易地接近，這種形貌非常有利于保留MWNTs的優(yōu)良性質(zhì)，從而能被完全和容易地用于促進(jìn)酶的電子傳輸.

圖1 CHIT-MWNTs復(fù)合材料的掃描電鏡圖Fig.1 SEM image of chitosan surface-decorated with MWNTs

2.2 CHIT-MWNTs-HPR/GCE的電化學(xué)行為

2.2.1 CHIT-MWNTs-HPR/GCE的直接電化學(xué)行為

圖2 不同修飾電極在PBS溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.2 CVs obtainded of different modified electrodes in PBS

2.2.2 掃速的影響

圖3是在pH=7.2的PBS溶液中，CHITMWNTs-HRP/GCE在不同掃速下的循環(huán)伏安圖.由圖3可以看出:當(dāng)掃速在0.02～0.30 V/s時(shí)，隨著掃速的增加，HRP直接電子轉(zhuǎn)移的氧化、還原峰電位幾乎不發(fā)生變化，由此可見該電極具有很好的電化學(xué)可逆性.且峰電流與掃速v之間均呈線性關(guān)系，如圖4所示.回歸方程分別為:Ipc=1.097 09×10－7+5.874 9×10－6(Ipc: A，v:V·s－1，r=0.999 83);Ipa=－3.725 98× 10－8－4.668 69×10－6v(r=0.999 63).說明HRP的電極過程受表面過程控制.隨著掃速的增大，氧化峰電位Epa向正方向移動(dòng)，還原峰電位Epc向負(fù)方向移動(dòng)，ΔEp逐漸增加，但式量電位E0'幾乎不變.

圖3 不同掃速下CHIT-MWNTs-HRP/GCE在PBS溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.3 CVs of GCE modified with HRP/CHIT-MWNTs composite film in PBS，CVs with different scan rate

圖4 掃速-峰電流圖Fig.4 Plot of the peak current vs scan rate

2.2.3 溶液pH值的影響

溶液的pH值與蛋白質(zhì)的直接電化學(xué)行為有很大關(guān)系.緩沖溶液的pH值對(duì)于HRP/CHITMWNTs修飾電極峰電位的影響如圖5所示.

隨著溶液pH的增大，HRP在CHIT-MWNTs修飾電極上氧化還原電位、式量電位均向負(fù)方向移動(dòng).這表明在HRP Fe3+/Fe2+之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的同時(shí)，伴隨有質(zhì)子的轉(zhuǎn)移.此外，在pH值為3～10區(qū)間內(nèi)，循環(huán)伏安曲線上的峰電位和峰電流的變化都是可逆的.如在 pH值為7.0時(shí)，HRP/CHIT-MWNTs膜修飾電極的循環(huán)伏安行為在經(jīng)過將電極浸入pH=10.0的緩沖溶液中后重新置入pH=7.0的緩沖液中這一過程后是可重現(xiàn)的，這表明CHIT-MWNTs膜能較好地保護(hù)HRP的生物活性.

圖5 CHIT-MWNTs-HRP/GCE在不同pH值的PBS溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.5 CVs of GCE modified with HRP/CHIT-MWNTs composite film in PBS at different pH values

2.2.4 CHIT-MWNTs-HRP/GCE對(duì)H2O2的電催化作用

為考察CHIT-MWNTs復(fù)合材料中HRP的生物電催化活性，利用循環(huán)伏安法研究CHITMWNTs-HRP/GCE對(duì)H2O2還原反應(yīng)的影響.如圖6所示，在pH=7.2的 PBS溶液中，CHITMWNTs-HRP/GCE產(chǎn)生了一對(duì)準(zhǔn)可逆的氧化還原峰，隨著H2O2的不斷加入，其循環(huán)伏安圖上氧化峰電流明顯減小，而還原峰電流明顯增加，這說明CHIT-MWNTs復(fù)合材料有效地保持了HRP對(duì)H2O2的生物電催化活性.圖6中b～k是在不同濃度的 H2O2-PBS溶液中 CHITMWNTs-HRP/GCE產(chǎn)生的循環(huán)伏安曲線.

圖6 CHIT-MWNTs-HRP/GCE在PBS溶液中分別加入H2O2的循環(huán)伏安圖Fig.6 CVs of GCE modified with HRP/CHIT-MWNTs composite film in PBS

由圖6可見，當(dāng)H2O2濃度在2.5×10－5～1.25×10－4mol·L－1范圍內(nèi)時(shí)，催化電流與H2O2濃度之間呈線性關(guān)系(見圖7)，線性回歸方程為:Ipc=6.368×10－8c+6.368×10－8(r= 0.99761，n=5)，其中 c為 H2O2濃度(單位mol·L－1)，Ipc為還原峰電流(單位A).

圖7 在PBS溶液中c(H2O2)與峰電位為－0.4 V處電流的線性關(guān)系圖Fig.7 Plot of the current vs the concentration of hydrogen peroxide

其中，Iss代表一定底物濃度下傳感器的穩(wěn)態(tài)相應(yīng)電流;Imax代表底物飽和條件下測(cè)得的最大穩(wěn)態(tài)電流;c為底物濃度.在一定范圍內(nèi)用圖7工作曲線中的數(shù)據(jù)作1/Iss～1/c圖，得到一條直線，根據(jù)該直線的斜率和截距求得=3.1×10－5mol·L－1.越小，表明酶與底物的親和力越大，酶的活性受抑制的程度越小.較小的Kappm說明CHIT-MWNTs-HRP/GCE對(duì)H2O2有較高的催化能力.同時(shí)，對(duì)CHIT-MWNTs-HPR/GCE的穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)試，將前述修飾電極在4℃下保存7 d后在相同條件下進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，電流沒有明顯變化，保存30 d后峰電流僅降低至89%，可見此修飾電極具有良好的穩(wěn)定性.

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)成功地將一種新型的殼聚糖表面修飾多壁碳納米管復(fù)合材料應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移，得出以下結(jié)論:

(1)合成的CHIT-MWNTs能在電極表面形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的修飾膜，為HRP提供一個(gè)合適的仿生微環(huán)境，極大地促進(jìn)了HRP與電極之間的電子轉(zhuǎn)移.

(2)通過掃速和pH值對(duì)固定化HRP直接電子傳遞的影響測(cè)定可知這是一個(gè)準(zhǔn)可逆的非擴(kuò)散控制的或薄層的電化學(xué)行為，在HRP中Fe3+/Fe2+之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的同時(shí)，伴隨有質(zhì)子的轉(zhuǎn)移.

(3)通過對(duì)過氧化氫催化活性的測(cè)定可知HRP對(duì)于H2O2的還原具有明顯的催化作用，電流響應(yīng)信號(hào)與過氧化氫濃度在 2.5×10－5～1.25×10－4mol·L－1間成線性關(guān)系，表觀Michaelis-Menten常數(shù)為3.1×10－5mol·L－1.

(4)制備的CHIT-MWNTs-HRP復(fù)合膜修飾玻碳電極對(duì)過氧化氫有著明顯的電催化活性，不需要額外的電子介體.這種新型的CHIT-MWNTs復(fù)合膜為電化學(xué)生物傳感的研究提供了一個(gè)優(yōu)良的平臺(tái).

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