不同毒力鉤端螺旋體引起THP-1細胞中細胞因子表達的研究

張彥，姜敘誠，郭曉奎，湯道強

1. 上海交通大學醫(yī)學院病原生物學教研室，上海 200025； 2. 上海交通大學醫(yī)學院病理學教研室，上海 200025； 3. 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院, 上海 200127

鉤端螺旋體病(leptospirosis，簡稱鉤體病)是一種由致病性鉤端螺旋體(Leptospira，簡稱鉤體)感染引起的常見的、威脅人類健康和畜牧業(yè)生產的全球性人畜共患病[1]。自1955年該病被列入法定乙類傳染病以來，我國許多地區(qū)均有鉤體病報告，尤其是在年降雨量多、年平均氣溫較高的長江流域及其以南省、自治區(qū)，鉤體病發(fā)病率高。

致病性鉤體具有很強的侵襲力，帶菌動物的尿液污染環(huán)境和水源后可通過破損的皮膚或黏膜侵入人體，進入血管后隨血流或經淋巴管和組織間隙播散并定植在全身多個臟器，導致鉤體病。鉤體病的主要臨床表現較不典型，常有發(fā)熱、肌肉酸痛、乏力和眼結膜充血等，嚴重者可出現黃疸和肝、腎、肺等多臟器廣泛出血，引起臟器功能障礙或衰竭而導致死亡。急性重癥鉤體病的病理形態(tài)學特點主要表現為肝、腎、肺等多臟器和黏膜等組織彌漫性出血和輕度炎性反應，發(fā)病機制尚不明確[2]。研究發(fā)現，不同毒力鉤體引起豚鼠體內炎癥細胞因子表達水平不同[3]。據報道，鉤體糖脂蛋白可誘導人外周血單核細胞釋放炎癥細胞因子[4,5]，Tajiki等也發(fā)現鉤體病患者血清中有較高水平的炎癥細胞因子[6]。細胞因子在鉤體病發(fā)病機制中的作用還不清楚，我們通過3種不同毒力鉤體與誘導后的人單核巨噬細胞株THP-1相互作用，應用實時聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)、白細胞介素12(interleukin 12，IL-12)和單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)在基因水平表達的改變，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測鉤體與細胞混合液上清液中TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1水平變化；同時應用實時PCR檢測細胞表面Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)、TLR4及誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)基因表達的改變，比較3株鉤體在激活巨噬細胞信號通路中的差異，探討鉤體的致病機制。

1 材料和方法

1.1 材料

問號鉤體賴型Lai株來源于四川省鉤體病患者，由中國疾病預防控制中心傳染病研究所提供。Lai株定期感染豚鼠，然后取發(fā)病期豚鼠肝或腎組織在鉤體培養(yǎng)基(EMJH)中置28 ℃需氧培養(yǎng)7～14 d，待鉤體長出，以此保持其毒力。問號鉤體賴型減毒株IPAV株由法國巴斯德研究所Saint-Girons教授和Picardeau博士饋贈。IPAV株是由有毒株Lai株在體外多次傳代毒力喪失形成的減毒株，Zhong等已完成其毒力鑒定及基因組和蛋白質組分析[7]。腐生性雙曲鉤體Patoc型Patoc l株由本研究中心保存。3株鉤體均在EMJH培養(yǎng)基中置28 ℃需氧培養(yǎng)至對數期備用。佛波酯(phorbol myristoyl acetate, PMA)購自Sigma公司，SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit購自大連TaKaRa公司，人細胞因子ELISA試劑盒購自R&D公司，ABI 7500 Fast為美國應用生物系統(tǒng)公司產品。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和誘導轉化將人單核巨噬細胞株THP-1置含10%胎牛血清(fetal calf serum，FCS)的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長接近融合時傳代，2～3代后的細胞用于實驗。調整好細胞濃度后加入終濃度為100 nmol/L的佛波酯, 加入6孔細胞培養(yǎng)板中誘導24～48 h；細胞貼壁轉化為巨噬細胞后吸出上清液，再用已滅菌的0.01 mol/L磷酸緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3次；加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細胞同步化，然后與鉤體相互作用。

1.2.2鉤體與細胞的相互作用3株鉤體均在EMJH培養(yǎng)基中置28 ℃需氧培養(yǎng)至對數期，暗視野顯微鏡下計數并計算鉤體濃度；4 000g離心20 min，用細胞培養(yǎng)液重懸鉤體沉淀物；調整濃度后加入到細胞培養(yǎng)孔中，使細胞與鉤體的比例為1∶100，作用0、2、12、24、48 h 后收集細胞與鉤體混合液上清液，-80 ℃保存。

1.2.3引物設計針對TLR2、TLR4、iNOS和細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1及β-actin基因設計實時PCR引物(表1)，并通過PCR和熔解曲線檢測引物的擴增效果和特異性。

表1Toll樣受體和各種細胞因子對應的引物

Tab.1Toll-likereceptorsandprimersofcytokines

CytokineSequence of oligonucleotide (5'-3')Size (bp)TLR2TLR4iNOSTNF-αIFN-γIL-12MCP-1β-actinGATGACTCTACCAGATGCCTCCCCAAATGAAGTTATTGCCACCAGCCGGGTAAGGAATGAGCTAGTAAAGGTGCTGGGACACCACAACAATCCCCAGCCTCAAGTCTTATTTCGCAAGTTCCATCTTTCACCCACGACGTGTACGTGGTAGAGTTGGCCTGGATGGTGAGGGTTTTACCCTGCCCCAATCCCTTTATCCCTAAGCCCCCAATTCTCTTTCAATGGGACGCTCTTTGTAGTCCTTCTTCGTTTCCTCTGGGCAGAAGTGGGTTCAGGATTCCTGGGTTGTGGAGTGAGTGTTCAGTGAAGGTGACAGCAGTCGGTTGAAGTGGGGTGGCTTTTAGGAT1441621791808016190157

1.2.4RNA抽提、純化和反轉錄將THP-1細胞沉淀物加入RNA抽提液TRIzol中，振蕩均勻后加入三氯甲烷劇烈振蕩，室溫靜置10 min，4 ℃、10 000g離心20 min。取上層水相轉移至新離心管中，加入等體積異丙醇，混勻沉淀，室溫放置10 min，4 ℃、12 000g離心10 min。去上清液，用無水乙醇洗滌沉淀物，離心后保留沉淀物，室溫干燥。待沉淀物干燥后，用不含RNase酶的ddH2O溶解RNA并測定濃度。用不含RNase酶的DNase酶消化RNA抽提中殘留基因組DNA以防污染，并用酚/氯仿抽提消除蛋白酶對后續(xù)實驗的影響。

1.2.5實時PCR檢測取1 μg純化的RNA用PrimeScriptTMRT Kit反轉錄為cDNA。取反轉錄后的cDNA溶液1 μl，用相對定量法檢測TLR2、TLR4、iNOS、TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1及β-actin基因的表達變化。所用熒光染料為SYBE GreenⅠ，計算方法為Ct值比較法，即2- ΔΔCt法，內參基因采用β-actin，用待測細胞因子與0小時對照組相應細胞因子的比值來間接表示THP-1細胞與3株鉤體相互作用后上述基因表達的變化。

1.2.6ELISA檢測將不同時間點的細胞與鉤體混合上清液4 ℃、4 000g離心20 min，取上清液稀釋1倍后用人細胞因子ELISA試劑盒雙抗夾心法檢測TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1的表達水平。步驟如下：將已包被相應抗人細胞因子單克隆抗體的ELISA 96孔板平衡至室溫，分別將標準濃度的細胞因子標準品和細胞上清液(100 μl/孔)加入相應孔中，用封板膠紙封住反應孔，37 ℃孵育90 min，洗板4次，每次3 min。除空白孔外，加入生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min，洗板4次，每次5 min。除空白孔外，每孔加入辣根過氧化物酶標記親和素工作液，37 ℃孵育30 min，洗板4次，每次5 min。然后每孔加入顯色劑3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)100 μl，避光37 ℃孵育15 min后，加入疊氮鈉終止液，混勻后即刻測量A450值。

1.3 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學分析軟件為SAS 6.0, 統(tǒng)計學分析方法為t檢驗、方差分析，P<0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 THP-1細胞中TLR2、TLR4、iNOS的表達改變

鉤體與THP-1細胞作用后，細胞中TLR2、TLR4、iNOS基因表達改變見圖1。結果顯示，Patoc 1株組THP-1細胞中TLR2表達升高，與Lai株和IPAV株組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。3株鉤體組THP-1細胞中TLR4和iNOS表達皆升高，但IPAV株組TLR4和iNOS表達上調更明顯，與Patoc 1株和Lai株組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

A: TLR2. B: TLR4. C: iNOS.*P<0.05 compared with Lai group,#P<0.05 compared with Patoc 1 group. The data are shown as means±SE of the ratio of cytokine to β-actin.

圖1不同毒力鉤體組THP-1細胞中TLR2、TLR4、iNOS基因表達的改變

Fig.1NormalizedrelativequantificationofmRNAexpressionbyreal-timePCRforTLR2,TLR4andiNOS

2.2 THP-1細胞中TNF-α、 IFN-γ、 IL-12、 MCP-1的表達改變

應用實時 PCR和ELISA分別檢測TNF-α、IFN-γ、IL-12、MCP-1在基因和蛋白水平表達的改變 (圖2)。 結果顯示， 3 株鉤體組THP-1細胞中TNF-α的表達和蛋白分泌皆升高，Patoc 1 株和IPAV株組比Lai株組更明顯，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。3株鉤體組THP-1細胞中MCP-1基因表達和蛋白分泌增高，雖然在基因水平3株鉤體組MCP-1表達有一定差異，但在蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義。

A: mRNA levels of TNF-α. B: Protein levels of TNF-α. C: mRNA levels of MCP-1. D: Protein levels of MCP-1.*P<0.05 compared with Lai group,#P<0.05 compared with Patoc 1 group. The data are shown as means±SE of the ratio of cytokine to β-actin.

圖2不同毒力鉤體組THP-1細胞中TNF-α、MCP-1表達的變化

Fig.2DetectionofTNF-αandMCP-1byreal-timePCRandELISA

3 討論

致病性鉤體可通過破損的皮膚或黏膜侵入人體，進入血管并隨血流或組織間隙播散至全身。一般細菌侵入人體后，人體免疫細胞表面的模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)，如TLR、甘露糖受體、清道夫受體等，通過識別細菌病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，其中主要包括脂多糖、磷酸聚糖、脂磷壁酸等，激活免疫細胞，釋放細胞因子，直接或間接調節(jié)機體的天然免疫和獲得性免疫應答[8]。到目前為止，共發(fā)現11種TLR，分布在免疫細胞表面及細胞內，通過信號轉導蛋白MyD88等傳遞信號，進一步激活核轉錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路，促使IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等表達，激活免疫細胞。其中TLR4主要識別革蘭陰性菌的脂多糖、革蘭陽性菌的脂磷壁酸等；TLR2主要識別革蘭陽性菌的肽聚糖及脂蛋白等。鉤體屬革蘭陰性菌。Yang等發(fā)現鉤體外膜脂蛋白LipL32通過TLR2激活腎小管上皮細胞NF-κB途徑，進而引起其下游基因iNOS、TNF-α、MCP-1表達增高[9]。Werts等也發(fā)現致病性問號鉤體波摩那型RZ11株脂多糖主要通過TLR2激活THP-1細胞，釋放炎性介質，且致病性鉤體脂多糖引起的細胞因子表達水平比非致病性鉤體低。作者認為避免TLR4的識別可能是致病性鉤體逃避宿主天然免疫的重要因素[10]。Viriyakosol等發(fā)現，熱滅活鉤體主要通過TLR4激活小鼠腹腔巨噬細胞釋放炎性介質TNF-α、IL-6和巨噬細胞炎性蛋白2(macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)，故小鼠體內TLR4信號途徑有利于宿主抵抗致病性鉤體的侵入，控制感染[11]。我們應用實時PCR檢測致病性鉤體賴型毒力株Lai株、賴型減毒株IPAV株和腐生性鉤體Patoc型Patoc 1株與THP-1細胞相互作用后對TLR2、TLR4、iNOS表達的影響，發(fā)現Patoc 1株可引起TLR2、TLR4和iNOS基因表達升高，而Lai株和IPAV株只引起TLR4和iNOS基因表達升高，且IPAV株引起的TLR4升高水平比Lai株高。未能檢測到Lai株激活TLR2，可能與所用菌株血清型不同有關。Goris等也認為，不同血清型的鉤體脂多糖結構可能有所不同；同時，他們發(fā)現致病性問號鉤體巴達維亞型Kariadisatu株可通過TLR2、TLR4和TLR5激活人外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)[12]，可見不同血清型以及同一血清型的不同菌株之間，激活巨噬細胞的通路存在差異。致病性鉤體進入體內后通過多種受體激活宿主的信號通路，不同信號通路之間相互交叉、相互促進或相互抑制，最終以某種信號通路為主導，激活機體的免疫應答。

革蘭陰性菌脂多糖可引起小鼠以大量炎癥細胞因子釋放為特征的全身性炎癥反應。鉤體屬革蘭陰性菌，但鉤體脂多糖誘導人PBMC釋放炎癥因子的能力比大腸埃希菌脂多糖誘導能力低[13]。熱滅活鉤體可引起人外周抗凝靜脈血中輔助性T細胞1型(T helper cell type 1，Th1)中細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-12p40表達升高[14]。致病性鉤體在引起PBMC釋放Th1細胞因子的同時，也可引起TCRγδ+T細胞增殖，并在鉤體病患者血液中檢測到TCRγδ+T細胞水平升高[15]。TCRγδ+T細胞可直接識別抗原，殺滅病原體，不受抗原呈遞細胞(antigen-presenting cell，APC)的限制，并分泌Th1和Th2細胞因子，調節(jié)免疫反應。我們應用實時PCR和ELISA分別在mRNA水平和蛋白水平檢測鉤體與THP-1細胞相互作用后THP-1細胞中TNF-α、IFN-γ、IL-12和MCP-1表達的變化。結果顯示，3株鉤體都能引起THP-1細胞中TNF-α和MCP-1表達增加，且Patoc 1株和IPAV株引起的TNF-α表達水平比Lai株高。由此推測，Patoc 1株和IPAV株引起細胞因子表達水平比Lai株高，可能有利于激活宿主的免疫反應，清除病原菌，控制感染。Vernel-Pauillac等將致病性鉤體感染豚鼠后，未死亡豚鼠外周血中TNF-α、IL-1α、環(huán)氧合酶2和IL-10表達水平低于死亡豚鼠[16]。Jongyota等將問號致病性波摩那型鉤體和非致病性雙曲鉤體Patoc 1株與THP-1細胞相互作用，發(fā)現致病性鉤體誘導THP-1細胞中IL-6表達水平低于非致病性雙曲鉤體[17]。在研究牛結核分枝桿菌感染中也發(fā)現，病理形態(tài)改變輕微的動物釋放更高水平的IFN-γ、iNOS，從而有利于殺滅細胞內的結核分枝桿菌，控制感染，降低病理損傷[18]。致病性鉤體與免疫細胞反應時，釋放的細胞因子表達水平低，有利于鉤體逃避宿主的免疫反應。本實驗中，THP-1細胞與鉤體作用后，皆未檢測出IFN-γ、IL-12基因表達和蛋白分泌，可能與所選細胞的種類及體內、外實驗差異有關。在結核分枝桿菌Beijing株感染早期，巨噬細胞被激活，釋放短暫的較高水平TNF-α和iNOS[19]，與體外實驗一致。但體外Beijing株與巨噬細胞相互作用同時引起IL-12p40和IP-18表達升高，引起Th1細胞因子表達增高，可見在體內還有其他細胞或菌體成分抑制保護性細胞免疫，且IL-12作用時間比較短暫[20]。Vernel-Pauillac等在鉤體病金黃地鼠模型中研究細胞因子表達的改變，IL-12的表達也只是一過性升高[21]。

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