廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制及其疾病診斷的研究進(jìn)展

范曉萍，張文宏

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海 200040

自20世紀(jì)90年代以來(lái)，全球結(jié)核病疫情回升，其中結(jié)核分枝桿菌耐藥是一重要原因。尤其是耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)的出現(xiàn)給全球結(jié)核病的控制帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。MDR-TB是指由至少對(duì)異煙肼(isoniazid，INH)和利福平(rifampicin，RMP)2種一線抗結(jié)核藥物耐藥的結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病。MDR-TB治療需要用二線抗結(jié)核藥物，但2000年全球開(kāi)始出現(xiàn)對(duì)二線抗結(jié)核藥物耐藥的XDR-TB。XDR-TB曾有多種不同定義方式，但因氟喹諾酮類藥物和二線抗結(jié)核藥物藥敏試驗(yàn)的可靠性和可重復(fù)性高，2006年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)將對(duì)氟喹諾酮類藥物和至少3種二線靜脈用抗結(jié)核藥物﹝卷曲霉素(capreomycin，CM)、卡那霉素(kanamycin，KM)、阿米卡星(amikacin，AM)﹞中1種耐藥的耐多藥結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病定義為XDR-TB[1]。最近大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道，2006年全球新增MDR-TB 500 000例，其中7% MDR-TB變異為高致病性XDR-TB。截至2008年底，已在55個(gè)國(guó)家和地區(qū)監(jiān)測(cè)到XDR-TB[2]。XDR-TB診治困難、費(fèi)用昂貴、治愈率低、病死率高，是結(jié)核病治療的一大難題。

1 流行病學(xué)

WHO和國(guó)際防癆和肺病聯(lián)合會(huì)(International Union Against Tuberculosis and Lung Disease，IUATLD)1994年建立了全球性抗結(jié)核藥物耐藥監(jiān)測(cè)計(jì)劃。截至2007年，抗結(jié)核藥物耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目已完成4輪，覆蓋109個(gè)國(guó)家和地區(qū)。2002～2007年第4輪監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，37個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)道了XDR-TB， 3 818 例MDR-TB病例中8.0%為XDR-TB(304例)；其中蘇聯(lián)等5個(gè)國(guó)家分別報(bào)道25例及以上XDR-TB，占MDR-TB的6.6%～23.7%[2]。XDR-TB的發(fā)病率地區(qū)間差異很大，在MDR-TB中所占比例從愛(ài)爾蘭的0%到塞爾維亞的33.3%不等。據(jù)WHO報(bào)道，2006年有充分藥敏結(jié)果的所有MDR-TB中，7%為XDR-TB。盡管現(xiàn)在缺乏全球性關(guān)于XDR-TB發(fā)病趨勢(shì)的資料，但MDR-TB的發(fā)病數(shù)從2000年約27萬(wàn)例增至2006年約49萬(wàn)例，據(jù)此推算，XDR-TB的發(fā)病例數(shù)也在增加[3,4]。截至2010年1月，已有58個(gè)國(guó)家和地區(qū)至少報(bào)道了1例XDR-TB病例。我國(guó)2007～2008年全國(guó)結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查發(fā)現(xiàn)，每年新發(fā)肺結(jié)核病約56萬(wàn)例，其中MDR-TB約12萬(wàn)例，XDR-TB約1萬(wàn)例。

2 廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生的危險(xiǎn)因素及耐藥機(jī)制

2.1 危險(xiǎn)因素

MDR-TB是XDR-TB產(chǎn)生的前提。MDR-TB的出現(xiàn)促使二線抗結(jié)核藥物的應(yīng)用，應(yīng)用過(guò)程中又出現(xiàn)了XDR-TB。多篇文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)核病不充分及不合理的治療與MDR-TB及XDR-TB密切相關(guān)。其中Karagoz等報(bào)道了土耳其Sureyyapasa胸心血管疾病教研醫(yī)院結(jié)核病患者的耐藥情況，新發(fā)結(jié)核病中MDR-TB發(fā)病率為3.2%，而先前接受治療的患者發(fā)病率為13.5%，后者遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于前者[5]。人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)合并感染亦與結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)，且HIV合并感染在新發(fā)病例中與對(duì)利福平單獨(dú)耐藥相關(guān)，與其他耐藥方式無(wú)關(guān)[6]。還有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，監(jiān)獄中犯人MDR-TB的發(fā)病率遠(yuǎn)高于正常人。如Mokaddas等報(bào)道，從佐治亞監(jiān)禁的患肺結(jié)核病犯人中分離的結(jié)核分枝桿菌對(duì)二線抗結(jié)核藥物高度耐藥，從接受過(guò)治療的MDR-TB患者中分離的結(jié)核分枝桿菌對(duì)2種或2種以上二線抗結(jié)核藥物耐藥的發(fā)生率為54%，在新發(fā)MDR-TB患者中為17%[7]。Law等對(duì)香港地區(qū)MDR-TB危險(xiǎn)因素進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)非常住人口、外出頻繁及年輕人與復(fù)治MDR-TB患者相關(guān)，而與初治患者無(wú)關(guān)[8]?，F(xiàn)代交通的發(fā)達(dá)使耐多藥結(jié)核分枝桿菌跨區(qū)域播散成為可能，傳播性耐藥值得引起重視[9]。

2.2 耐藥機(jī)制

XDR-TB的產(chǎn)生主要有以下幾種機(jī)制：獲得性耐藥、擴(kuò)大性耐藥和傳播性耐藥。這3種耐藥機(jī)制的成因不同。

編碼抗結(jié)核分枝桿菌藥物靶點(diǎn)及相關(guān)代謝酶的染色體基因突變是結(jié)核分枝桿菌耐單藥產(chǎn)生的主要分子機(jī)制[10,11]。耐多藥是因?yàn)槎喾N藥物靶基因突變，對(duì)結(jié)核病患者個(gè)體來(lái)說(shuō)耐藥性來(lái)源于自發(fā)性突變[12]，染色體多個(gè)相互獨(dú)立基因自發(fā)突變逐步累加是產(chǎn)生XDR-TB的分子基礎(chǔ)；多數(shù)廣泛耐藥分離株存在耐單藥相關(guān)基因改變，推測(cè)廣泛耐藥的產(chǎn)生由相關(guān)耐單藥基因突變、多代遺傳積累所致。盡管就單個(gè)患者來(lái)說(shuō)自發(fā)突變率很低，但對(duì)于載菌量大的患者，針對(duì)某種藥物的基因突變所致耐藥還是可能的。對(duì)長(zhǎng)期應(yīng)用一種抗結(jié)核藥物的患者，該藥物的耐藥性很快被篩選出來(lái)，以耐該藥的結(jié)核分枝桿菌占主導(dǎo)地位，該耐藥形式稱為獲得性耐藥(acquired resistance)[13,14]。

XDR-TB的治療需要至少4種有效藥物或部分有效藥物，或5～7種療效不確切的藥物。治療至痰陰轉(zhuǎn)后18個(gè)月，如病變廣泛 ，應(yīng)延長(zhǎng)到24個(gè)月，治療時(shí)可選擇的有效抗結(jié)核藥物有限。對(duì)常見(jiàn)抗結(jié)核藥物耐藥的結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因見(jiàn)表1。

表1與結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)的基因[7]

Tab.1GeneticmutationsrelatedtoresistanceofMycobacteriumtuberculosis

Antituberculosis drugMutated genePercentage of mutationGene productIsoniazidkatG40%-60%Catalase-peroxidase (activates INH)Isoniazid-ethionamideinhA15%-43%Reductase analog (mycolic acid synthesis)IsoniazidahpC10%Hydroperoxidase reductaseIsoniazidkasAUnknownCarrier protein synthaseRifampicinrpoB>96Subunit of RNA polymerasePyrazinamidepncA72%-97%PyrazinamidaseEthambutolembB47%-65%ArabinosyltransferaseStreptomycinrpsL70Ribosomal protein S12Streptomycinrrs7016S rRNAFluoroquinolonesgyrA75%-94%DNA gyrase A subunit

結(jié)核病的治療必須應(yīng)用2種及以上敏感藥物，藥物短缺、質(zhì)量差，治療不當(dāng)，患者依從性差，自行停藥或終止治療可導(dǎo)致耐藥結(jié)核病產(chǎn)生，還可導(dǎo)致抗結(jié)核治療過(guò)程中結(jié)核分枝桿菌的耐藥譜逐步增加，即擴(kuò)大性耐藥(amplified resistance)[13]。

耐藥結(jié)核分枝桿菌可通過(guò)與患者直接接觸而傳播，該耐藥形式稱為傳播性耐藥(transmitted resistance)[13]，也稱為原發(fā)性耐藥(primary resistance)。有數(shù)據(jù)表明，與MDR-TB患者接觸后發(fā)展為耐藥活動(dòng)性肺結(jié)核的概率較高，故對(duì)所有與結(jié)核病患者接觸的人都應(yīng)進(jìn)行密切監(jiān)測(cè)。XDR-TB患者病死率更高，對(duì)與其接觸者應(yīng)進(jìn)行更嚴(yán)密的監(jiān)測(cè)，及早發(fā)現(xiàn)，及早治療，減少傳播。

獲得性耐藥主要是在抗結(jié)核藥物壓力下對(duì)天然存在的染色體突變的選擇，主要由不恰當(dāng)化療造成，反映的是結(jié)核病治療管理的質(zhì)量。原發(fā)性耐藥患者所占比例高低主要反映當(dāng)?shù)啬退幗Y(jié)核分枝桿菌傳播水平的高低，是評(píng)價(jià)與制定結(jié)核病控制和規(guī)劃的重要依據(jù)。

3 診斷

快速、準(zhǔn)確的藥敏試驗(yàn)對(duì)結(jié)核病的預(yù)防、控制至關(guān)重要，但目前結(jié)核病的診斷率低。WHO預(yù)計(jì)2005年痰菌陽(yáng)性的新發(fā)結(jié)核病患者確診率達(dá)70%，但該目標(biāo)遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有實(shí)現(xiàn)[15]。目前診斷耐藥結(jié)核病的診斷方法有多種，主要有以下幾種。

3.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法

目前的“金標(biāo)準(zhǔn)”是瓊脂比例法(agar proportion method)[16,17]，可準(zhǔn)確計(jì)算對(duì)某種藥物耐藥的結(jié)核分枝桿菌比例。有實(shí)驗(yàn)比較改良羅氏培養(yǎng)基直接比例法與廣泛應(yīng)用的改良羅氏培養(yǎng)基間接比例法，前者在MDR-TB發(fā)病率為2%、5%、20%和50%的人群中效價(jià)比最高。然而液體培養(yǎng)法(liquid culture method)對(duì)于一線抗結(jié)核藥物更可靠[16,17]。氟喹諾酮類藥物和靜脈用二線抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)相對(duì)其他二線藥物更準(zhǔn)確、可靠。然而傳統(tǒng)培養(yǎng)方法需8～12周，有一定的滯后性，在治療過(guò)程中可能會(huì)有新的耐藥結(jié)核分枝桿菌出現(xiàn)，不能及時(shí)反映目前耐藥情況。

3.2 液體培養(yǎng)基法

自動(dòng)化液體培養(yǎng)系統(tǒng)有更高的敏感度，但需2～4周出結(jié)果，且費(fèi)用昂貴。BACTEC-460 輻射測(cè)量系統(tǒng)可連續(xù)檢測(cè)接種標(biāo)本的培養(yǎng)管熒光強(qiáng)度變化，判斷是否有結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)，目前該系統(tǒng)已被結(jié)核桿菌生長(zhǎng)指示管(Mycobacteriagrowth indicator tube)960系統(tǒng)取代。后者可快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)一線、二線抗結(jié)核藥物的耐藥情況，僅需數(shù)天即可出結(jié)果，但費(fèi)用較昂貴。2007年WHO公布了在資源貧乏地區(qū)液體培養(yǎng)法、藥敏試驗(yàn)及快速菌種鑒定的指導(dǎo)政策。

3.3 快速表型檢測(cè)法

快速表型檢測(cè)法包括鏡下藥敏檢測(cè)法(microscopic observation drug-susceptibility assay，MODS)、TK medium、FASTPlaque-Response等。以傳統(tǒng)方法作標(biāo)準(zhǔn)，MODS對(duì)利福平藥敏一致率為100%，對(duì)異煙肼藥敏一致率為97%，對(duì)利福平合并異煙肼藥敏一致率為99%，對(duì)乙胺丁醇和鏈霉素的藥敏一致率略低，分別為95%和92%。MODS的最大缺點(diǎn)是需要倒置顯微鏡觀察結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)情況[18]。TK培養(yǎng)基是一種比色法，可在菌落長(zhǎng)出前通過(guò)觀察培養(yǎng)基的顏色改變來(lái)檢測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)活性，并可鑒別結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌，也可進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，但目前尚缺乏該方面的文獻(xiàn)資料。FASTPlaque-Response是一種噬菌體擴(kuò)增法，可直接應(yīng)用于痰標(biāo)本，并可對(duì)含有藥物的標(biāo)本進(jìn)行藥敏檢測(cè)。該方法敏感度高，但特異度較差，目前缺乏直接應(yīng)用于痰標(biāo)本的足夠證據(jù)。

3.4 免疫學(xué)方法

近年來(lái)發(fā)展了新的細(xì)胞免疫檢測(cè)方法——γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon γ release assay，IGRA)，即用結(jié)核分枝桿菌抗原與可疑感染者的全血或單個(gè)核細(xì)胞體外37 ℃孵育過(guò)夜，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(enzyme-linked immunosorbent spot，ELISPOT)法測(cè)定致敏T細(xì)胞受抗原刺激后IFN-γ釋放水平，從而判定是否有結(jié)核分枝桿菌感染[19]。但該法受患者自身免疫條件影響，敏感度、特異度不夠，且不能鑒別潛伏期結(jié)核和活動(dòng)性結(jié)核。

3.5 分子生物學(xué)新技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)可在數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)檢測(cè)出對(duì)某種抗結(jié)核藥物耐藥的結(jié)核分枝桿菌特定基因突變，不需要結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)，且敏感度較傳統(tǒng)方法大大提高。如表1所示，對(duì)利福平耐藥患者中，結(jié)核分枝桿菌95%有rpoB基因突變[17]。因利福平單耐藥率低，所以可將利福平耐藥檢測(cè)作為MDR-TB統(tǒng)計(jì)的替代指標(biāo)。GenoTypeMTBDR線性探針技術(shù)對(duì)利福平耐藥檢測(cè)的敏感度、特異度高，可直接用于抗酸染色陽(yáng)性的呼吸道分泌物標(biāo)本及培養(yǎng)株檢測(cè)[16]。GenoTypeMTBDRplus可用于對(duì)異煙肼耐藥的inhA基因啟動(dòng)子區(qū)域及對(duì)利福平耐藥的rpoB基因的熱點(diǎn)突變區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)。該方法對(duì)異煙肼耐藥檢測(cè)的敏感度為84%(70%～90%)，特異度為99%[16]。目前已開(kāi)發(fā)出針對(duì)二線藥物檢測(cè)的GenoTypeMTBDRsl技術(shù)。DNA直接測(cè)序是檢測(cè)耐藥基因突變的另一方法，準(zhǔn)確率高，但費(fèi)用昂貴，需要特定的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。分子生物學(xué)技術(shù)可以迅速、準(zhǔn)確檢測(cè)出針對(duì)某種抗結(jié)核藥物耐藥的結(jié)核分枝桿菌突變基因，但并不是針對(duì)所有的耐藥藥物都能檢測(cè)到相應(yīng)的基因突變，到目前為止還有許多抗結(jié)核藥物耐藥相應(yīng)突變基因未能發(fā)現(xiàn)。此外，不同藥物的基因突變有不同的地理分布特點(diǎn)，目前還缺乏統(tǒng)一的分子生物學(xué)方法作為檢測(cè)未知耐藥基因的標(biāo)準(zhǔn)，需進(jìn)一步對(duì)不同地區(qū)耐藥基因特點(diǎn)進(jìn)行研究，以建立統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)語(yǔ)

XDR-TB治療指南推薦對(duì)每個(gè)患者必須采用從標(biāo)準(zhǔn)化、經(jīng)驗(yàn)化到個(gè)體化的治療方案，根據(jù)患者用藥情況、藥敏結(jié)果制訂合理的治療方案，采取DOTS-Plus方法，指導(dǎo)并監(jiān)測(cè)患者用藥。目前XDR-TB治療效果缺乏大樣本、多中心的文獻(xiàn)資料。MDR-TB治療時(shí)間長(zhǎng)，至少18～24個(gè)月，需應(yīng)用昂貴、毒性大、療效差的二線藥物。描述性研究發(fā)現(xiàn)，其治療成功率遠(yuǎn)低于敏感結(jié)核病，僅為75%[20]。XDR-TB治療效果比MDR-TB更差，病死率和治療失敗率更高[21,22]，尤其是在合并HIV感染的患者。

總之，XDR-TB治療時(shí)間長(zhǎng)，病死率高，治療效果差，目前可用藥物種類有限、費(fèi)用昂貴、不良反應(yīng)多。目前尚缺乏快速、準(zhǔn)確的診斷方法，藥敏試驗(yàn)診斷技術(shù)的滯后是耐藥結(jié)核分枝桿菌傳播及耐藥產(chǎn)生的重要原因之一，亟需開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確的新型診斷方法。加強(qiáng)對(duì)耐藥結(jié)核病患者的管理，規(guī)范耐藥結(jié)核病患者的治療，同時(shí)應(yīng)對(duì)與XDR-TB患者接觸的人群及潛伏期XDR-TB患者進(jìn)行有效治療,減少耐藥結(jié)核分枝桿菌的傳播。對(duì)XDR-TB的治療是一項(xiàng)任重而道遠(yuǎn)的任務(wù)，需要醫(yī)務(wù)工作者、研究人員、政府等多方的共同努力。

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