DNA聚合酶Ⅰ的功能與結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)

向義和

教授，清華大學(xué)物理系，北京 100084

本文具體介紹了DNA聚合酶Ⅰ的功能與結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)過程，包括聚合酶活性中心模型的提出；聚合酶分子量的測定；聚合酶的分離及其活性片段的獲得；聚合酶Klenow片段晶體結(jié)構(gòu)的測定以及DNA結(jié)合部位與活性位點的確立；Klenow片段結(jié)合DNA的晶體結(jié)構(gòu)以及噬菌體T7DNA復(fù)制的晶體結(jié)構(gòu)的測定，在測定這些復(fù)合物共晶體的基礎(chǔ)上，提出了DNA與聚合酶結(jié)合的右手模型。

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymeraseⅠ，縮寫為polⅠ）是在1957年由科恩伯格（A.Kornberg）及其合作者發(fā)現(xiàn)的第一個DNA聚合酶。在各種DNA聚合酶中，這種酶研究得最透徹。它的一些特點代表了DNA聚合酶的基本特點，顯示出DNA聚合酶的主要特征。DNA聚合酶Ⅰ是一種多功能酶，除了具有5′→3′聚合酶活性以外，還具有3′→5′外切核酸酶活性和5′→3′外切核酸酶活性。

1969年，科恩伯格研究了各種各樣的DNA結(jié)構(gòu)與聚合酶的結(jié)合，提出了DNA聚合酶的活性中心模型，顯示了在這個活性中心內(nèi)的幾種活性位點，表示了錯配堿基被外切核酸酶切除和DNA聚合酶的修復(fù)過程。同年，科恩伯格和他在斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系的同事還用沉降平衡法確定了DNA聚合酶的相對分子量，并通過蛋白水解作用把DNA聚合酶剪切成兩個片段，較大的片段保持了聚合酶活性和3′→5′外切核酸酶活性，小片段包含了5′→3′外切核酸酶活性。1985年，Steitz等人獲得了第一個聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)，使人們首次看到DNA合成機制的細致結(jié)構(gòu)。他們提出了DNA結(jié)合部位和3′→5′外切核酸酶活性位置。1993年，他們又獲得了DNA聚合酶Ⅰ的大片段——Klenow片段結(jié)合DNA的晶體結(jié)構(gòu)，提出了一個在聚合酶裂縫中，DNA的結(jié)合位置模型。1998年，Doublie等人獲得了噬菌體T7DNA復(fù)制的晶體結(jié)構(gòu)，以2.2?最短距離分辨的復(fù)合物。2008年，沃森（J.D.Watson）等人根據(jù)Doublie等人的實驗結(jié)果描繪出DNA與聚合酶結(jié)合的右手模型圖。

1 聚合酶活性中心模型的提出

1969年，科恩伯格把研究DNA聚合酶功能的成果總結(jié)成題為“DNA聚合酶的活性中心”的論文，發(fā)表在Science第163卷上。文章一開始就寫道：“現(xiàn)在已經(jīng)從各種各樣細菌的和動物的細胞中分離出DNA聚合酶，包括隨病毒感染而特別產(chǎn)生的這些酶，它們起催化作用，把單核苷酸單位加到引物DNA鏈的3′－羥基端。因此合成在5′→3′方向進行。絕對需要有一個DNA模板，而且在復(fù)制模板時很少發(fā)生錯誤。DNA的合成以每個酶分子每分鐘大約加上1000個核苷酸的速率迅速地進行，隨之產(chǎn)生具有幾百萬分子量的鏈?！保?］

科恩伯格小組通過沉降平衡確定了均勻聚合酶的相對分子量是109 kDa。這個大分子量以及聚合酶和多種核酸酶活性的存在表明，DNA聚合酶具有亞單位結(jié)構(gòu)。他們做了聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗。實驗表明，超過95%的蛋白質(zhì)按照聚丙烯酰胺凝膠電泳遷移到pH值為3.5，8和11處形成三條單一的帶。他們認為：“這個結(jié)果表明DNA聚合酶是與由單條多肽鏈組成的結(jié)構(gòu)，或者是由兩個或更多個相同的亞單位組成的結(jié)構(gòu)。然而，由于每個分子量是109 kDa的聚合酶包含一個硫氫基（SH）和一個二硫鍵（在兩個硫原子之間形成的共價鍵）基，多個相同亞單位組成的可能性就被排除在外。因為用碘乙酸或者用汞離子能夠改變硫氫基，從而產(chǎn)生具有全部聚合酶和外切核酸酶活性的衍生物，所以這個硫氫基大概不是活性位置的部位。這個帶有汞離子的反應(yīng)或是產(chǎn)生每個蛋白質(zhì)分子具有一個汞原子的聚合酶單體，或是在存在過量酶的情形下產(chǎn)生具有由汞原子連接的兩個蛋白質(zhì)分子的二聚體。這個二聚體也有全部活性?！保?］

1.1 DNA結(jié)合部位

他們用各種各樣的DNA結(jié)構(gòu)（圖1）研究DNA與聚合酶的結(jié)合。用脫氧核糖核酸酶部分地水解脫氧腺苷酸和脫氧胸苷酸交替的共聚物（dAT），通過凝膠過濾或聚丙烯酰胺凝膠電泳從這些水解物中分離出寡聚體，獲得了大約具有24個和40個核苷酸殘基（d（AT）12和d（AT）20）鏈長的制劑。根據(jù)寡聚體在低離子濃度中的熔解和迅速地冷卻導(dǎo)致他們假設(shè)這個寡聚體具有發(fā)夾型結(jié)構(gòu)。

圖1 在研究酶結(jié)合中使用的各種各樣的DNA結(jié)構(gòu)

他們用包含有3H或32P標(biāo)記的DNA和203Hg標(biāo)記的聚合酶的混合物的蔗糖密度梯度離心測量DNA與聚合酶的結(jié)合。這個混合物在梯度的頂端分層，在沉降后辨別DNA與酶的復(fù)合物。用過量的酶，d（AT）12與酶幾乎定量地沉降，說明它們之間具有很高的結(jié)合親和力。自由酶以沉降系數(shù)6.1S沉降，而這個聚合酶－dAT復(fù)合物是以7.7S沉降。具有過量存在的dAT寡聚體，所有的酶像一個具有等摩爾量dAT的復(fù)合物以7.7S沉降，說明DNA聚合酶包含一個與dAT寡聚體結(jié)合的位置。這些結(jié)果與用d（AT）20獲得的結(jié)果一樣。在把末端是3′－羥基和3′－磷酸基的寡聚體的結(jié)合加以比較時，沒有檢測到差別。

聚合酶與單鏈環(huán)形ΦX174DNA結(jié)合，在這個復(fù)合物中每個DNA分子大約結(jié)合20個酶分子。一個雙鏈閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA完全不與聚合酶相結(jié)合。然而，當(dāng)使這些雙鏈形式變性成為單鏈時，單鏈以正比于它的長度與聚合酶結(jié)合，而且達到像單鏈病毒ΦX174DNA相同的程度。

他們已經(jīng)用胰性脫氧核糖核酸酶把切口引入質(zhì)粒DNA和ΦX174復(fù)制形式。這些切口有3′－OH和5′－P末端，而且是復(fù)制的活性點。用微球菌核酸酶引入的切口，產(chǎn)生的3′－OH和5′－P末端不是復(fù)制的活性點；它們抑制復(fù)制。無論切口的種類如何，形成復(fù)合物的聚合酶分子在數(shù)量上恰好等于切口數(shù)（圖2中的插圖）。圖2中的沉降曲線，峰Ⅰ表示聚合酶分子結(jié)合到質(zhì)粒的完整的雙圓環(huán)形式，峰Ⅱ表示聚合酶分子結(jié)合到質(zhì)粒的切口形式。

圖2 切口質(zhì)粒DNA結(jié)合到酶

在表1中總計了DNA結(jié)構(gòu)與聚合酶的結(jié)合。在螺旋區(qū)域完全沒有結(jié)合。沿著單股鏈到切口和末端有結(jié)合。在噬菌體T7的線性雙鏈體DNA的情形下，我們的制劑平均每2個分子包含1個切口；這就解釋了為何每個T7DNA分子結(jié)合2.6個酶分子。

表1 DNA結(jié)構(gòu)對DNA結(jié)合到DNA聚合酶的影響

1.2 酶的多重功能

為了在酶的活性中心開始構(gòu)建一個可能發(fā)生的許多操作的模型，在這里他們想把結(jié)合實驗的結(jié)果與他們已經(jīng)研究的酶的催化性質(zhì)聯(lián)系起來。這些操作包括：①DNA鏈按照核苷酸的聚合作用沿5′→3′方向生長；②DNA鏈從3′－OH端水解（3′→5′方向）；③DNA鏈從5′端水解（5′→3′方向）；④DNA鏈從3′端進行焦磷酸解作用；⑤無機焦磷酸（PPi）與脫氧核糖核苷三磷酸的末端焦磷酸基團交換。

他們把酶活性中心畫為特別適宜于識別并調(diào)節(jié)幾個核苷酸結(jié)構(gòu)的多肽面（圖3）。他們提出在這個活性中心內(nèi)至少有5個主要的部位：① 有一個部分模板鏈的部位（template site）。這個區(qū)域結(jié)合形成堿基對的這段鏈，它的任一邊有幾個核苷酸長度，這條鏈以特定的極性取向，很可能是結(jié)合環(huán)形單鏈DNA的部位。但是我們不能確定，這個部位是認可伸展的構(gòu)型還是認可緊密、重疊的螺旋構(gòu)型。②有一個生長鏈的引物部位（primer site），這個引物的取向與模板的極性取向相反。③有一個特別認可的具有核苷酸的3′－OH基團的引物末端部位（primer terminate site）。以后我們將討論這個區(qū)域，作為3′－OH－末端引物鏈（3′→5′方向）水解的和焦磷酸解的剪切部位。④有一個三磷酸的部位（triphosphate site）。⑤有一個以后要考慮的，為5′－P－端鏈（5′→3′方向）的水解剪切提供的附加的部位。

圖3 在DNA聚合酶的活性中心內(nèi)的部位

1.3 聚合階梯

當(dāng)一個線性雙鏈體從3′－OH末端部分地被降解時，就確定的外切核酸酶作用的例子而言，這些被剝?nèi)サ牟糠直凰械腄NA聚合酶以極大的可能性修復(fù)，這是如何完成的？

在接近引物末端核苷酸上的3′－OH基團處結(jié)合三磷酸并調(diào)整其方向，以便三磷酸與引物能夠進行直接的連接并與模板形成一個堿基對（圖4）。當(dāng)形成正確的堿基對時，發(fā)生了由引物端的3′－OH對三磷酸最內(nèi)部的磷進行親核的攻擊。由于下述的理由，一個似乎合理的模型假設(shè)引物鏈相對于酶的運動或平移是與二酯鍵的形成一致的。當(dāng)這個引物端平移進二酯鍵中，失去它的3′－OH基團時，它就不再占有這個引物端位置。通過整條鏈的運動，舊的引物端被一個具有末端3′－OH基團且保持在引物端部位的新加入的核苷酸取代。（現(xiàn)在這個新的引物端準(zhǔn)備攻擊另一個三磷酸，并加上下一個核苷酸）。只有當(dāng)磷酸二酯鍵的形成完成時無機焦磷酸才被置換，而鏈的運動正好把新加的核苷酸轉(zhuǎn)移到引物端部位。

圖4 聚合階梯的機制

2 聚合酶亞單位結(jié)構(gòu)的證實

2.1 聚合酶分子量的測定

1969年6月，科恩伯格在斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系的同事 T.M.Jovin，P.T.Englund和L.L.Bertsch在The Journal of Biological Chemistry第244卷上發(fā)表“DNA的酶合成：（26）均勻DNA聚合酶的物理和化學(xué)研究”的論文［2］。在這篇文章中，他們通過沉降平衡確定了DNA聚合酶的相對分子量是109 kDa。

沉降平衡法是從密度梯度離心技術(shù)發(fā)展起來的一種方法。樣品放入離心管內(nèi)的溶液中，進行離心，溶液沉降，幾小時后達到平衡，則形成穩(wěn)定的密度梯度。樣品在離心管中運動，樣品中密度大于周圍溶液密度的向管底沉降，而密度小于周圍溶液密度的樣品向液面浮起。這兩種運動一直延續(xù)到所有樣品都到達某一平衡位置，形成平衡區(qū)帶。

科恩伯格的同事們利用沉降平衡法計算DNA聚合酶分子量的公式如下：

上式中M是分子量，V和ρ分別是比容和溶液密度，T是絕對溫度，R是氣體常數(shù)，ω是角速度，r是離轉(zhuǎn)軸的徑向距離，θ或△Z′是從零干涉水平上垂直條紋的位移，或者是△ji／2，在半條紋單位內(nèi)從零濃度的位移。為了求得微商，他們按照實驗值繪出了lnθ對r2的關(guān)系曲線（圖5）。圖5A中所顯示的是在T＝279.2 K，ω＝20410rpm的稀釋緩沖液中獲得的數(shù)據(jù)，顯示出沒有偏離直線性。圖5B所顯示的是在T＝298 K，ω＝27690rpm時，在包含6M胍鹽酸和0.3M的二硫基乙醇溶液中獲得的的數(shù)據(jù)，同樣沒有偏離直線性。在細胞內(nèi)達到的蛋白質(zhì)的最大濃度是8 mg／L。在兩種情形下，獲得的分子量都是109 kDa。

圖5 DNA聚合酶的平衡沉降

2.2 聚合酶的活性片段

1969年，科恩伯格和他在斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系的同事D.Brutlag，M.R.Atkinson和P.Setlow在Biochemical and Biophysical Research第37卷上發(fā)表題為“由蛋白水解剪切產(chǎn)生的DNA聚合酶的活性片段”的論文。文章一開始就說：“大腸桿菌DNA聚合酶是具有109 kDa分子量的單條多肽鏈，在單個活性中心催化幾種反應(yīng)。在DNA引物的3′端有與聚合反應(yīng)密切聯(lián)系的3′→5′外切核酸酶活性，焦磷酸交換和焦磷酸解作用。脫氧核苷三磷酸底物的結(jié)合部位被認為是靠近有缺口的DNA的催化5′→3′外切核酸酶降解的另一個酶的位置。本文敘述了通過蛋白水解作用把DNA聚合酶剪切成兩個分子量為76 kDa和34 kDa的片段，這個較大的片段保持了聚合酶活性和3′→5′核酸酶活性，但是沒有5′→3′核酸酶功能?！保?］

他們使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離聚合酶并測定其分子量。電泳是指帶電粒子在直流電場中移動的現(xiàn)象。不同的成分在均一的緩沖液中分離成獨立的區(qū)帶，可以用染色的方法顯示出來，如果用光密度計掃描可得出一個個互相分離的峰。聚丙烯酰胺凝膠是一種多孔凝膠，它根據(jù)蛋白質(zhì)的兩個參數(shù)來進行分離：①蛋白質(zhì)的凈電荷；②蛋白質(zhì)的分子大小。聚丙烯酰胺俗稱“電泳分子篩”，具有很高的分辨率［4］。

如果在上述凝膠電泳系統(tǒng)中加入陰離子去污劑SDS（十二烷基硫酸鈉），那么蛋白質(zhì)就能解離成亞基。它們的電泳行為只與其分子大小有關(guān)，而與它所帶的電荷無關(guān)，故可用這一性質(zhì)測定蛋白質(zhì)亞基的分子量。經(jīng)驗表明：在一定的凝膠濃度下，其泳動率與分子量的對數(shù)呈直線關(guān)系。因此先由一些已知分子量的蛋白質(zhì)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過對比，便可測知未知蛋白質(zhì)樣品的分子量，還可判斷出是否存在亞基［4］。

他們指出：“大腸桿菌DNA聚合酶是具有109 kDa分子量的單條多肽鏈的證據(jù)包括SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（圖6A）……從液氮儲存器取出酶的樣品并在0℃時保持在緩沖液中達四周就會產(chǎn)生兩條帶（圖6C）。主要的條帶處在分子量為76 kDa的位置，連同處在分子量為34 kDa的微弱帶。這個分離的酶仍然顯示出具有初始測定的全部聚合酶活性。在用分離的酶合成多聚d（A－T）中聚合作用有助于完成反應(yīng)，而且不降解d（A－T）產(chǎn)物，像使用正常的酶一樣。這就表明在分離的聚合酶中不存在核酸酶功能?！保?］

圖6 DNA聚合酶的SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

聚合酶的分離是由蛋白酶催化肽鍵水解的結(jié)果。他們研究了幾種包括枯草桿菌提取物、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶BPN的蛋白酶對聚合酶的作用（圖6C，D，E和F）。就每種情形下出現(xiàn)的聚合酶的剪切而論，在分離的聚合酶中看到的降解的圖樣最像用枯草桿菌提取物處理的情形。超過90%的聚合酶被剪切，產(chǎn)生76 kDa和34 kDa分子量的片段與少許中間大小的產(chǎn)物（大約53 kDa）。胰蛋白酶也產(chǎn)生76 kDa分子量片段作為主要的產(chǎn)物，除此之外還有大量53 kDa分子量的物質(zhì)。胰凝乳蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶BPN對限定剪切的產(chǎn)生影響很小，雖然在降解的產(chǎn)物中能夠辨認出76 kDa分子量的片段。

他們通過凝膠過濾分離了由枯草桿菌提取物，蛋白水解聚合酶的產(chǎn)物。被分離的酶顯示出聚合酶活性的增大和在5′→3′方向上核酸酶活性的減少。表2中聚合酶活性的速率表示為每個酶分子每分鐘結(jié)合的核苷酸分子數(shù)。核酸酶活性的速率表示為每個酶分子每分鐘釋出的核苷酸分子數(shù)。用胰蛋白酶處理也引起聚合酶活性的增加（約增加了1.5倍）。通過長時間的處理，它自身分子量降解為76 kDa，聚合酶活性降低。

表2 分離前后聚合酶活性的比較

蛋白水解聚合酶的凝膠過濾是這樣進行的：先用DNA聚合酶處理枯草桿菌提取物，而后經(jīng)G－75交聯(lián)葡萄糖柱層析這些產(chǎn)物，再用磷酸鉀緩沖液洗脫。洗脫的結(jié)果如圖7所示，圖中在每個峰下合并的組分用Ⅰ和Ⅱ表示。組分Ⅰ的電泳顯示出它是具有76 kDa分子量的單條帶（﹥90%）。聚合酶功能和3′→5′外切核酸酶功能屬于分子量為76 kDa的片段（表2）。當(dāng)時在任何一個分離組分中沒有探測到5′→3′核酸酶活性。后來的實驗證明分子量為34 kDa的小片段沒有聚合酶活性只包含5′→3′外切核酸酶活性。

圖7 蛋白水解聚合酶的凝膠過濾

3 聚合酶結(jié)構(gòu)的確立

1985年2月耶魯大學(xué)分子生物物理和生物化學(xué)系教授T.A.Steitz等人在Nature上發(fā)表了題為“大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段與胸苷一磷酸復(fù)合的結(jié)構(gòu)”的論文。宣布他們獲得了第一個聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)，大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ）的蛋白水解的大片段。指出：“這個分子是相對分子量為103000（即103 kDa）的單體，它有三種酶的活性：DNA聚合酶，被認為是消除錯配核苷酸的3′→5′外切核酸酶和5′→3′外切核酸酶。限定的蛋白水解把分子分解成兩個片段；大的C端片段（Klenow片段）具有DNA聚合酶和3′→5′外切核酸酶活性，而小的 N端片段具有5′→3′外切核酸酶活性?！保?］

作者接著指出：“DNA聚合酶的活性位置和校正錯配堿基的3′→5′外切核酸酶的活性位置在某種程度上在PolⅠ上是分離的。聚合酶活性位置結(jié)合著包含單鏈5′延伸的雙鏈DNA和脫氧核苷三磷酸（dNTP）。雖然脫氧單磷酸（dNMP）也結(jié)合到polⅠ，但是它們并不沖突，因為它們的結(jié)合位置是分開的。由產(chǎn)物的抑制性推測起來，因為dNMP抑制3′→5′外切核酸酶活性而不抑制聚合酶活性，dNMP好象是結(jié)合到的3′→5′外切核酸酶活性位置?！保?］

1987年8月Steitz等人在Trends in Biochemical Sciences上發(fā)表題為“DNA聚合酶Ⅰ：從晶體結(jié)構(gòu)到功能的遺傳學(xué)研究”的論文。他們進一步指出：“結(jié)構(gòu)的、生物化學(xué)的和遺傳學(xué)研究的結(jié)合導(dǎo)致polⅠ有三個領(lǐng)域，每個領(lǐng)域擔(dān)負著一種分離的酶的活性的結(jié)論（圖8）。polⅠ的限定的蛋白水解除去了包含5′→3′外切核酸酶活性的34 kDa的N端區(qū)域。留下的68 kDa大片段（Klenow片段）具有我們最感興趣的聚合作用和刪除活性。如下所述，Klenow片段結(jié)構(gòu)有對應(yīng)于性質(zhì)不同的聚合作用和刪除功能。這兩個活性位置大約相距30?，引起了兩種活性以什么方式一起工作的一些有趣的問題。”［6］

圖8 大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的近似的區(qū)域結(jié)構(gòu)示意圖（實線表示實驗上確定的Klenow片段結(jié)構(gòu)；虛線表示由polⅠ的蛋白水解剪切產(chǎn)生的小片段可能的定位）

3.1 Klenow片段的結(jié)構(gòu)

在上述1985年的論文Klenow片段的結(jié)構(gòu)一節(jié)中，他們把Klenow的晶體結(jié)構(gòu)分成大區(qū)域和小區(qū)域兩個領(lǐng)域。明確指出大區(qū)域最明顯的結(jié)構(gòu)特征是在標(biāo)記I和O的螺旋之間存在一條很大的裂縫，類似于右手的形狀，手指和拇指對應(yīng)于O螺旋和I螺旋（圖9）。

圖9 Klenow片段的三維結(jié)構(gòu)（圓柱體表示α螺旋；箭頭表示β折疊片構(gòu)型；I和O螺旋間的裂縫很可能是與DNA相互作用的位點）

他們寫道：“這個大區(qū)域的400個氨基酸（521→928殘基）主要是以α螺旋構(gòu)型出現(xiàn)，形成包含一條很深裂縫的結(jié)構(gòu)，類似于握著一根桿的右手的形狀（圖9）。6條絞合的反平行的β片形成了裂縫的底部。在任何一邊α螺旋的大的伸出部分形成了它的邊。這條裂縫20～24?寬，25～35?深，具有伸進裂縫的兩個α螺旋，J和K。這個裂縫的一條邊是比較長的（是50?而不是20?），能夠與右手彎曲的手指比較。主要由兩條長的α螺旋I和H形成了其他的壁，I和H從蛋白質(zhì)伸出并像一個拇指附著于裂縫?！保?］

接著指出小區(qū)域具有結(jié)合脫氧核苷單磷酸（dNMP）和二價金屬離子的功能。他們說：“我們發(fā)現(xiàn)這個片段折疊成兩個截然不同的區(qū)域（圖9）。較小的片段大約是polⅠ序列中的頭200個殘基（324→517）。形成在兩邊上具有α螺旋，中心是多數(shù)平行的β折疊片。脫氧核苷單磷酸結(jié)合到靠近β鏈的羧基端區(qū)域。這個小區(qū)域包含了一個與蛋白質(zhì)和脫氧胸苷單磷酸（dTMP）相互作用的結(jié)合金屬離子。把摻入 Zn2＋，Mn2＋，Sm3＋或 Mg2＋的晶體和沒有金屬離子的晶體比較，揭示了能夠結(jié)合這些金屬離子中任何一種離子的牢固的結(jié)合位置……被Asp355（天冬氨酸355），Glu357（谷氨酸357）和Asp501的羰基（carboxylate group）把金屬離子結(jié)合到蛋白質(zhì)上。在dTMP復(fù)合物中，這個5′磷酸基給金屬離子提供了第4個配體?！保?］

3.2 DNA的結(jié)合部位

關(guān)于DNA結(jié)合部位的研究來自于對各種與引物－模板接頭結(jié)合的DNA聚合酶的原子結(jié)構(gòu)的研究。這些結(jié)構(gòu)揭示了DNA底物位于一個大的、形似一只半握的右手的裂縫之中。在1985年的論文“DNA結(jié)合部位”一節(jié)中，Steitz T A等人明確指出DNA結(jié)合部位位于I和Q之間的大裂縫之中。他們寫道：“這個大裂縫的尺寸和形狀表明它結(jié)合DNA合成的雙鏈體產(chǎn)物。如果J和Kα螺旋部分地處于較大的裂縫中（圖10），B－DNA就適合于這個裂縫。雖然在J和K螺旋之間又有結(jié)構(gòu)上和功能上的類似，而且這兩個螺旋的特色為一些調(diào)節(jié)蛋白所共有，但是似乎沒有穩(wěn)固的結(jié)構(gòu)上的相應(yīng)物。當(dāng)聚合酶沿著DNA滑動時，要求蛋白質(zhì)做螺旋運動，在PolⅠ中兩個螺旋可能對于把DNA的平移位置附于蛋白質(zhì)上起作用。這個裂縫的一邊大約是50長，可能對DNA螺旋軸的定向起作用。它也能夠結(jié)合單鏈模板?！保?］

他們指出：“polⅠ的結(jié)構(gòu)表明它具有持續(xù)合成能力的機制。也就是說，在它斷絕和DNA底物的關(guān)系以前，照其他聚合酶反應(yīng)中共有的樣子，它具有把許多核苷酸結(jié)合到DNA的能力。在我們的模型中柔性地附著在I和H螺旋的頂部50個殘基子域的定位表明在DNA結(jié)合之后這個小的子域阻塞了這個裂縫。于是，如果這個蛋白質(zhì)隔絕了它的DNA底物，DNA產(chǎn)物解離的速率可能很慢，如果比聚合速率慢很多，就可能導(dǎo)致連續(xù)的聚合。這個酶就可能簡單地滑動到在聚合階梯的新的3′端。”［5］

圖10 雙鏈DNA的結(jié)合位置（用連接磷位置的線表示雙鏈DNA，引物端可能的定位用PR標(biāo)記）

他們繼續(xù)寫道：“對于引物鏈3′端的定位雖然我們沒有證據(jù)，在圖10中提出的位置好象是可能的。這個引物端處在以下的情況：①盡可能靠近dTMP；②與蛋白質(zhì)互相配合；③允許合成的單鏈模板鏈和蛋白質(zhì)之間的相互作用；④處在最靠近N末端的DNA端，像切口平移所需要的從N端取出的小片段。作為一種選擇，我們試圖用附著到核苷單磷酸的觀察位置的DNA3′端建立一個酶－DNA 模型。”［5］

3.3 3′→5′外切核酸酶活性位置

在1987年的論文［6］的“3′→5′外切核酸酶活性位置”一節(jié)中，指出：“這個晶體結(jié)構(gòu)顯示dNMP結(jié)合到Klenow片段的小區(qū)域（圖11）。因為脫氧核苷單磷酸抑制3′→5′外切核酸酶反應(yīng)（根據(jù)抑制產(chǎn)物推測），很有可能在晶體中dNMP的結(jié)合位置與在外切核酸酶活性位置中DNA3′端的位置一致。因此，這個dNMP磷酸基將表示在外切核酸酶反應(yīng)中被切開的磷酸二酯鍵的位置?！保?］

圖11 具有結(jié)合分子dCMP的3′→5′外切核酸酶活性位置

Klenow片段結(jié)構(gòu)的精制證實其它晶體學(xué)的數(shù)據(jù)，表明dNMP結(jié)合區(qū)域包含兩個二價金屬離子的位置（圖11）。由Asp355，Glu357和Asp501的羰基與提供了第4個配體的dNMP 5′磷酸基協(xié)調(diào)一個金屬離子（位置A）。Mg2＋或者Zn2＋甚至在dNMP不存在時也能夠結(jié)合到晶體中的這個位置。第2個二價金屬離子定位在dNMP磷酸基和Asp424的羰基之間（位置B）。用EDTA（乙二胺四乙酸）除去結(jié)合到晶體的dNMP從而分離二價金屬離子是與早期的平衡透析研究一致的。

為了研究兩個金屬離子的作用，他們通過定位誘變產(chǎn)生兩個突變蛋白質(zhì)。由于金屬B和Asp424相聯(lián)的邊鏈鄰近dNMP磷酸基，他們引起突變Asp→Ala424。當(dāng)純化到均勻時，這個最后得到的蛋白質(zhì)具有野生型聚合酶活性的水平，但是基本上沒有外切核酸酶活性。對與dNMP復(fù)合的這個蛋白質(zhì)的高分辨晶體學(xué)分析表明：dNMP和金屬A的結(jié)合是正常的。與野生型復(fù)合物唯一的差別是Asp424羰化物和在位置B處金屬離子的不存在。于是在Asp→Ala424時，蛋白質(zhì)中外切核酸酶活性的丟失好象是除去金屬位置B的直接的結(jié)果，從而提出在催化中這個金屬離子起著直接的作用。他們還通過造成雙突變Asp→Ala355，Glu→Ala357，消除了金屬A位置的兩個配體。這個突變的蛋白質(zhì)也具有聚合酶活性，但是沒有外切核酸酶活性。低分辨晶體學(xué)的研究表明，大的和小的區(qū)域結(jié)構(gòu)都未被干擾；然而這個晶體沒有結(jié)合dNMP，或者沒有結(jié)合在位置A和B中任何一個金屬離子。因為在金屬B不存在時能夠結(jié)合dNMP（像由Asp→Ala424突變所示的一樣），這個結(jié)果意味著在底物結(jié)合中包含金屬位置A，雖然在催化中沒有把附加的作用排除在外。

在1987年論文的的最后一節(jié)中，作者寫道：“通過在聚合酶反應(yīng)中選擇正確的dNTP和通過刪除錯誤結(jié)合的堿基獲得了由polⅠ合成的精確的DNA?？贫鞑裥〗M證實了3′→5′外切核酸酶反應(yīng)的刪除能力，他們說明這個活性能夠排除在引物端錯配的堿基對。在聚合酶反應(yīng)中dNTP選擇的機制和其他刪除步驟可能的存在現(xiàn)在還不清楚。因此我們將把我們的討論限制在3′→5′外切核酸酶反應(yīng)的刪除作用上。”［6］

他們接著指出：“現(xiàn)在在研究中的Klenow片段－DNA共晶體顯示出在外切核酸酶活性位置中的DNA 3′端并允許我們推測這個‘刪除復(fù)合物’的結(jié)構(gòu)。在共晶體中看到的單鏈DNA端能夠很容易地聯(lián)想到已經(jīng)建立的在大區(qū)域上結(jié)合裂縫的引物鏈模型（圖12）?！保?］

圖12 當(dāng)引物鏈的3端處在外切核酸酶位置（exonuclease active site）時Klenow片段結(jié)合到DNA分子上的示意圖（引物端從聚合酶活性位置到外切核酸酶活性位置運動的范圍用加黑的鍵表示）

3.4 聚合酶結(jié)合DNA結(jié)構(gòu)的確定

1993年，Steitz等人在Science第260卷上發(fā)表題為“DNA聚合酶ⅠKlenow片段結(jié)合雙鏈體DNA”的論文。［7］在引言中作者首先概述了與雙鏈體DNA共結(jié)晶的大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段。他們說：“我們把11個DNA堿基對置入處在與裂縫成直角的溝內(nèi)，這條裂縫包含了聚合酶活性位置并與3′→5′外切核酸酶區(qū)域相鄰接。當(dāng)Klenow片段與DNA結(jié)合時，一個以前被認為是無序的區(qū)域成為更加有序的區(qū)域，與兩條螺旋一起朝著3′→5′外切核酸酶區(qū)域運動形成這條結(jié)合溝。在單鏈區(qū)域的3′端，以三個核苷酸長度結(jié)合在外切核酸酶活性位置。雖然這個共結(jié)晶的結(jié)構(gòu)好像是一個編排的復(fù)合物，但是它表明這條引物鏈從3′→5′外切核酸酶區(qū)域的方向接近聚合酶的催化位置，而這條雙鏈DNA產(chǎn)物可能彎折到進入包含聚合酶催化位置的裂縫。［7］”接著明確指出：“在這個晶體結(jié)構(gòu)中，催化這些反應(yīng)的兩個活性位置大約相距35??！庇终f：“聚合酶反應(yīng)的催化位置定位在這個大裂縫的底部。這個區(qū)域包含了在聚合酶序列中許多高度保守的殘基。”［7］

最后，他們在觀察復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，描繪了一個既刪除又聚合復(fù)合物模型，如圖13所示。他們提出：“這個引物－模板（primer－template）結(jié)合在聚合酶裂縫中。在聚合酶裂縫中，這條引物鏈堿基是與模板的堿基配對的，而它的3′端是靠近結(jié)合到催化重要的Asp882，Glu883和Asp705的兩個二價金屬離子。由于觀察到的裂縫狹窄需要雙鏈體引物端的某些變形或蛋白質(zhì)的運動。引物鏈的位移必然把模板鏈帶到引物端，使螺旋區(qū)域縮短，形成與拇指（thumb）子域?qū)?yīng)的裂縫的壁。雖然這個DNA位于聚合酶裂縫內(nèi)，像在原來的模型中一樣，但是這個假設(shè)的DNA合成的方向是相反的。包含了引物端的這個雙鏈體DNA位于鄰近外切核酸酶區(qū)域的裂縫邊緣，而這條單鏈模板鏈從這條裂縫的的頂部進入?！保?］

圖13 DNA的結(jié)合位置模型（聚合酶活性位置P；3′到5′外切核酸酶活性位置E）

關(guān)于聚合酶裂縫的彎折他們作了如下的說明：“相對于聚合酶裂縫1在裂縫2中DNA螺旋軸的角度是料想不到的。如果人們構(gòu)造一個模型，要保持多數(shù)觀察到的在雙鏈體DNA和蛋白質(zhì)之間的縮短，那么構(gòu)筑的這個DNA模型大約需要彎折80°才能進入聚合酶裂縫（圖13）。雙鏈體DNA的這種誘導(dǎo)蛋白的彎折是知道的。這個分解代謝物基因激活蛋白與DNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)表明，主要通過兩個43°彎折達到 DNA彎折90°?！保?］

3.5 聚合酶復(fù)合物結(jié)構(gòu)的確定

1998年，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)和分子藥物系教授Doublie等人在Nature上發(fā)表題為“噬菌體T7DNA復(fù)制的晶體結(jié)構(gòu)——以2.2最短距離分辨的復(fù)合物”的論文。介紹了在聚合酶活性位置處從與引物－模板和核苷三磷酸復(fù)合的噬菌體T7中提出的最短分辨距離為2.2的復(fù)制DNA聚合酶的晶體結(jié)構(gòu)。

在本文“復(fù)合物結(jié)構(gòu)的確定”一節(jié)中，作者寫道：“T7DNA有一個在polⅠ家族中為其他聚合酶特有的結(jié)構(gòu)，具有氨基（－NH2）端的3′→5′校對外切核酸酶區(qū)域和羧基（COOH）端的聚合酶區(qū)域。這個聚合酶區(qū)域有一個使人聯(lián)想起右手的形狀，在右手中這個手掌、手指和拇指形成導(dǎo)致聚合酶活性位置的DNA－結(jié)合溝（圖14）。這個引物模板的定位，使3′引物端處在手指和拇指的匯合處，靠近ddGTP。這個手掌形成了聚合酶活性位置的基底，顯示出三個嚴(yán)格保守的和功能上重要的酸性殘基。兩個金屬離子通過兩個保守的羰化物和依次連接這個結(jié)合ddGTP的磷酸基而保持在這個位置（圖15）。這些手指圍在DNA結(jié)合溝端部的外邊，引起與結(jié)合核苷酸的許多相互作用……這個結(jié)構(gòu)的保守性在手掌中是最明顯的，在那里T7DNA聚合酶的β－鏈9，12和13很好地疊在類似的Klenow片段的鏈上。這個3′→5′外切核酸酶區(qū)域處在遠離手指的DNA結(jié)合溝的末端，類似于在Klenow片段中的定位。在T7DNA聚合酶中，嵌入大拇指頂部71個殘基形成一個結(jié)合到硫氧還蛋白擴展的環(huán)上，懸在退出聚合酶的雙鏈體DNA上?！保?］

圖14 T7DNA聚合酶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)

圖15 結(jié)合核苷酸的兩個金屬離子的連接作用

2008年，在沃森（J.D.Watson）等人編著的《基因的分子生物學(xué)》一書中，根據(jù)Doublie等人的實驗結(jié)果描繪出DNA與聚合酶結(jié)合的右手模型圖。他們寫道：“關(guān)于DNA聚合酶如何催化DNA合成的分子解釋，來自于對各種引物－模板接頭結(jié)合的DNA聚合酶的原子結(jié)構(gòu)的研究。這些結(jié)構(gòu)揭示了DNA底物位于一個大的、形似一只半握的右手的裂縫之中（圖16），依據(jù)對手的類比，聚合酶的3個結(jié)構(gòu)域被稱為拇指、手指和手掌。”［9］

圖16 模板DNA穿過DNA聚合酶的路徑示意圖

關(guān)于聚合酶這三個結(jié)構(gòu)域的作用，他們指出手掌域由β折疊片構(gòu)成，含有催化位點的基本元件，這一區(qū)域的2個二價金屬離子可以改變dNTP和3′引物端周圍的化學(xué)環(huán)境，起催化作用。除此之外，還負責(zé)檢查新加入的核苷酸堿基配對的準(zhǔn)確性。手指域?qū)Υ呋埠苤匾Ｒ坏┮氲膁NTP與模板之間形成正確的堿基配對，手指域即發(fā)生移動，包圍住dNTP。聚合酶手的這種閉合形式可以使引入的核苷酸與催化性的金屬離子密切接觸，從而促進催化反應(yīng)。手指域還與模板結(jié)合，使模板的磷酸二酯鍵骨架在活性部位后立即產(chǎn)生約90°的回折，此彎曲僅使催化位點上引物后的第一個模板堿基暴露。模板的這種構(gòu)象避免了在下一個核苷酸添加時可能會造成的對配對的模板堿基選擇的混淆。拇指域與催化的關(guān)聯(lián)不緊密，而是與最新合成的DNA相互作用，維持引物與活性部位的正確位置，以及聚合酶與其底物的緊密連接。這種連接有助于聚合酶每次與引物－模板接頭結(jié)合時，具有添加許多dNTP的能力。

（2011年3月17日收到）

［1］KORNBERG A .Active center of DNA polymerase［J］.Science，1969，163：410－1418.

［2］JOVIN T M，ENGLUND P T，BERTSCH L L.Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid：XXVI.physical and chemical studies of a homogeneous deoxyribonucleic acid polymerase［J］.The Journal of Biological Chemistry，1969，244（11）：2996－3008.

［3］BRUTLAG D，ATKINSON M R，SETLOW P，KORNBERG A.An active fragment of DNA polymerase produced by proteolytic cleavage ［J］.Biochemical and Biophysical Research，1969，37：982－989.

［4］何忠效.生物化學(xué)實驗技術(shù) ［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：168，175，176，356，357.

［5］OLLIS D L，BRICK P，HUONG R，STEITZ T A.Structure of large fragment of Escherichia coli DNA polymerase Ⅰ complexed with dTMP［J］.Nature，1985，313：762－766.

［6］JOYCE C M，STEITZ T A.DNA polymeraseⅠ：from crystal structure to function via genetics［J］.Trends Biochem Sci，1987，12：288－292.

［7］BEESE LORENA S，DERBYSHIRE V，STEITZ T A.Structure of DNA polymeraseⅠKlenow fragment bound to duplex DNA ［J］.Science，1993，260：352－355.

［8］DOUBLIE S，TABOR S，LONG A M，et al.Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2?resolution［J］.Nature，1998，391：251－258.

［9］沃森J D，等，編著.基因的分子生物學(xué)（第六版）［M］.楊煥明，等，譯.北京：科學(xué)出版社，2009：203－207.