基于FTIR技術(shù)和HPLC法的廣西不同石山地區(qū)兩面針化學(xué)成分比較分析Δ

鄭娟梅，韋文俊，雷欣潮，黃庶識(shí)，韋柳花，沈亮

（1.廣西科學(xué)院生物物理實(shí)驗(yàn)室，南寧市 530007；2.廣西中醫(yī)學(xué)院，南寧市 530001；3.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧市 530005）

基于FTIR技術(shù)和HPLC法的廣西不同石山地區(qū)兩面針化學(xué)成分比較分析Δ

鄭娟梅1，2＊，韋文俊2，雷欣潮2，黃庶識(shí)1#，韋柳花3，沈亮3

（1.廣西科學(xué)院生物物理實(shí)驗(yàn)室，南寧市 530007；2.廣西中醫(yī)學(xué)院，南寧市 530001；3.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧市 530005）

目的：研究?jī)擅驷樀募t外光譜特征及不同石山地區(qū)兩面針?biāo)幉牡牟町悾⒔Y(jié)合高效液相色譜（HPLC）法分析廣西不同石山地區(qū)兩面針中生物堿的差異。方法：采集廣西不同石山地區(qū)兩面針?biāo)幉?，制備傅里葉變換紅外光譜（FTIR）圖，運(yùn)用主成分分析法（PCA）研究不同譜圖間的差異，結(jié)合HPLC法測(cè)定氯化兩面針堿的含量。結(jié)果：兩面針?biāo)幍牡乩砦恢谩⒕暥?、氣候、年降雨量、土壤等外在條件不同，均能使其化學(xué)成分的含量存在差異。結(jié)論：運(yùn)用FTIR技術(shù)可以快速鑒別出不同石山地區(qū)兩面針主要化學(xué)成分的差異，并能夠準(zhǔn)確把握藥材的整體信息。

兩面針；傅里葉變換紅外光譜技術(shù)；高效液相色譜法；石山地區(qū)；氯化兩面針堿

兩面針為蕓香科植物兩面針Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.的干燥根[1]，主要分布于浙江、廣西等地，全國(guó)各地多有栽培[2]。其主要活性成分為生物堿類，含量約0.7%。主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、牙痛、胃痛、咽喉腫痛、毒蛇咬傷等癥[3]。紅外光譜技術(shù)在“指紋”區(qū)能快速區(qū)別不同的中藥材，它可以對(duì)中藥材全組分進(jìn)行直接測(cè)定，反映制劑整體信息[4～5]。筆者運(yùn)用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜（HPLC）法研究?jī)擅驷樀募t外指紋特征及其在廣西不同石山地區(qū)在紅外“指紋”區(qū)化學(xué)成分之間的光譜差異[6]，為建立直接、快速和準(zhǔn)確測(cè)定兩面針有效成分的試驗(yàn)方法，科學(xué)評(píng)價(jià)兩面針?biāo)幉馁|(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

Nicolet 5700FTIR儀，包括DTGS/B檢測(cè)器、CTO-20A柱溫箱、CBM-20A工作站（美國(guó)Thermo公司）；BT-224S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；HW-3A型溫控紅外烘箱（天津港東科技發(fā)展股份有限公司）；HPLC儀，包括LC-20A二元泵、SIL-20A標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-20A紫外-可見檢測(cè)器、CTO-20A柱溫箱、CBM-20A工作站（日本島津公司）。

兩面針?biāo)幉模ǜ稍锔┎捎趶V西南寧、崇左市8個(gè)不同石山地區(qū)產(chǎn)地，經(jīng)廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院黃榮韶教授鑒定為蕓香科植物兩面針Z.nitidum（Roxb.）DC.；氯化兩面針堿對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111665-200401）；乙腈為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 FTIR法

樣品于55℃干燥48h，粉碎過(guò)200目，每個(gè)樣品作20個(gè)重復(fù)。各樣品稱取1.0mg，與溴化鉀（碎晶）混合研磨充分，壓制成厚度約1mm的錠片，將錠片放入紅外光譜儀測(cè)定，每個(gè)片隨機(jī)掃3個(gè)不同的點(diǎn)，再取其平均譜圖作為最后的樣品譜圖。試驗(yàn)測(cè)試條件：光譜范圍為4000～400cm-1；光譜分辨率為4cm-1；掃描次數(shù)32次。

2.2 HPLC法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：UltimateTM×B-C8（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-（0.2%三乙胺+0.2%磷酸）緩沖液（30∶70）；柱溫：35℃；流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：272nm；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按氯化兩面針堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取氯化兩面針堿對(duì)照品5.60mg，加適量無(wú)水乙醇使之溶解并定容于25mL量瓶中，制備成氯化兩面針堿濃度為0.175mg·mL-1的對(duì)照品貯備液。再精密量取5mL，置10mL量瓶中，制備成氯化兩面針堿濃度為88μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取各產(chǎn)地兩面針?biāo)幉拇址奂s1g，精密稱定，加95%乙醇25mL，回流2次，每次2h，過(guò)濾，合并濾液，用95%乙醇定容至50mL量瓶中，搖勻后以1000r·min-1離心，取上清液作為供試品溶液。取10μL注入色譜儀，依法測(cè)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 兩面針的紅外光譜特征分析

兩面針的一維和二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖分別見圖1A、B。

由圖1A可以看出，兩面針的紅外光譜圖是典型的階梯狀圖譜，主要分三段：3750～2000cm-1、2000～900cm-1、900～400cm-1。在第一波段范圍內(nèi)出現(xiàn)了2個(gè)（組）吸收峰，分別為：3415cm-1處寬帶振動(dòng)，主要是-OH伸縮振動(dòng)峰和氨基酸中N－H鍵伸縮振動(dòng)的疊加；2937cm-1處是一個(gè)強(qiáng)的、尖銳的吸收峰，是亞甲基-CH2的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰的疊加。此波段可以認(rèn)為是蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)對(duì)光譜的貢獻(xiàn)[7]。圖1A、B顯示，兩面針紅外光譜圖2000～900cm-1波段范圍內(nèi)一維和二階導(dǎo)數(shù)出現(xiàn)了19個(gè)（組）吸收峰，此波段應(yīng)歸屬為α，β-不飽和酯鍵、C＝C或芳環(huán)骨架振動(dòng)的疊加峰[8]。在1742cm-1處是五元環(huán)酮[ν（C＝O）]的吸收峰；1675、1596、1580cm-1處的3個(gè)峰提示有生物堿（鵝掌楸堿）的羰基C＝O存在[9]；1658cm-1處為酰胺的吸收帶Ⅰ[ν（C＝O）]，1542cm-1處為吸收帶Ⅱ[δ（N－H）]，重疊為寬峰[10]，因此可以指認(rèn)為酰胺的特征峰；1646cm-1處是C＝C或芳環(huán)骨架振動(dòng)的疊加峰；1596～1466cm-1波段的一組吸收峰為苯環(huán)骨架振動(dòng)峰；1427cm-1附近的一組吸收峰是由C－H的變角振動(dòng)引起的；1376cm-1處是由-CH3的彎曲振動(dòng)引起的；1324cm-1處是由芳香胺N-H的彎曲振動(dòng)引起的；1160cm-1處的肩峰是糖類的C－OH的伸縮振動(dòng)峰[11]；1160、1032、1081、987cm-1處均有明顯的吸收峰，為糖類的主峰；另外，931、861、712cm-1等處均體現(xiàn)出糖類的輔峰?？梢?，此波段主要是生物堿、酯類、糖類和苷類等物質(zhì)的特征吸收。第三波段范圍內(nèi)的吸收峰較少、強(qiáng)度較低，主要是分子的骨架振動(dòng)和變角振動(dòng)。綜上所述，兩面針主要含有生物堿、酯類、醇類、苷類、多糖類等化學(xué)成分，這跟前人研究結(jié)果一致[9]。

3.2 兩面針不同產(chǎn)地的紅外光譜比較分析

不同石山地區(qū)兩面針的紅外光譜圖見圖2。

從圖2可以看出，不同石山地區(qū)兩面針的紅外光譜的峰位無(wú)明顯差別，但在1740～1034cm-1波段范圍的峰強(qiáng)度卻有明顯的差異，在1640、1500、1034cm-1處差異最為明顯。從兩面針紅外光譜特征分析可知，在這些波段主要是生物堿、糖類物質(zhì)的特征吸收。其原因主要是因?yàn)闃颖舅幍牡乩砦恢?、緯度、氣候、土壤等外在條件的不同而使兩面針化學(xué)成分的含量存在差異。

為了提高光譜的特異度與靈敏度，以便更好地尋找廣西不同石山地區(qū)兩面針紅外光譜的異同，本研究采用主成分分析（PCA）多元統(tǒng)計(jì)方法對(duì)廣西不同石山地區(qū)兩面針紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。PCA是利用降維處理技術(shù)，將原來(lái)多個(gè)變量化為少數(shù)互不相關(guān)的主成分，從而描述數(shù)據(jù)集內(nèi)部結(jié)構(gòu)的一種統(tǒng)計(jì)分析手段[12]。廣西不同石山地區(qū)兩面針的PCA分析結(jié)果分別見圖3A～D。

由圖3可知，A和C的三維散點(diǎn)圖由第一主成分（PC1）、第二主成分（PC2）及第三主成分（PC3）組成，且3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)99%。在PC2中廣西不同石山地區(qū)的兩面針明顯處于不同位置。從圖3A中散點(diǎn)的分布可以看出，馬山縣、崇左市和天等縣各自處于相對(duì)獨(dú)立的空間，與其他區(qū)域有明顯區(qū)分；但大新縣和寧明縣間有部分重疊，寧明縣和天等縣2個(gè)產(chǎn)地樣本的點(diǎn)雖然沒有重疊，但是相距較近。初步說(shuō)明馬山縣、崇左市和天等縣的兩面針與其他兩面針的紅外光譜差異較大，而三維中具有重疊部分的不同產(chǎn)地間紅外光譜差異相對(duì)較小?？梢姡ㄟ^(guò)PCA法可以將廣西不同石山地區(qū)的兩面針紅外光譜在一定程度上加以區(qū)分。

圖3B是不同石山地區(qū)兩面針的PCA中第二主成分的載荷（loading pc2）。從圖3B可知，其對(duì)應(yīng)的1624、1575、1490、1324、931、861、787、507cm-1等11個(gè)紅外峰在PC2中起最關(guān)鍵的作用。此波段主要是糖類物質(zhì)的特征吸收，所以幾個(gè)不同產(chǎn)地的樣本的差異反映在糖類物質(zhì)的含量不同，說(shuō)明本研究中廣西不同石山地區(qū)糖類物質(zhì)的含量存在較大的差異?？赡苁且?yàn)榇笮?、寧明、天?個(gè)縣是相鄰的地處桂西南的邊境縣，地理位置（緯度）、自然環(huán)境、氣候條件相似，來(lái)自這3個(gè)縣的樣本化學(xué)成分、含量相近，導(dǎo)致PCA分析結(jié)果中三產(chǎn)地的樣本點(diǎn)發(fā)生重疊。而崇左市在上述3個(gè)縣東100多千米處，馬山縣在其東北300多千米處，地理位置、氣候等條件與其有較大不同，使得崇左市和馬山縣的樣本與上述3個(gè)縣的樣本得以較好的區(qū)分。

圖3 PCA分析結(jié)果A.不同產(chǎn)地兩面針的PCA分析結(jié)果；B.不同產(chǎn)地兩面針PCA的loading pc2；C.大新縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)兩面針的PCA分析結(jié)果；D.大新縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)兩面針PCA的loading pc2；1.大新縣城郊；2.寧明縣；3.馬山縣；4.天等縣；5.崇左市郊；6.大新縣碩龍鎮(zhèn)；7.大新縣上古嶺；8.大新縣欖圩鎮(zhèn)Fig3 Results of PCAanalysisA.PCA results of Z.nitidum from different producing areas；B.loading pc2of PCA of Z.nitidum from different producing areas；C.PCA results of Z.nitidum from different towns of Daxin county；D.loading pc2of PCA of Z.nitidum from different towns of Daxin county；1.suburban of Daxin county；2.Ningming county；3.Mashan county；4.Tiandeng county；5.suburban of Congzuo city；6.Shuolong town of Daxin county；7.Shangguling of Daxin county；8.Lanxu town of Daxin county

圖3C是大新縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)樣本的PCA三維圖。從圖3C可以看出，大新縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)之間的樣本在一定程度上有區(qū)分，其縣城與碩龍鎮(zhèn)的樣本點(diǎn)部分重疊，上古嶺和欖圩鎮(zhèn)的樣本處于相對(duì)獨(dú)立的空間，更容易區(qū)分。

圖3D是大新縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)樣本PCA第二主成分的載荷（loading pc2），在1800～500cm-1波段出現(xiàn)了15個(gè)（組）存在差異的峰。此波段主要是生物堿和糖類物質(zhì)的特征吸收，反映了不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)樣本化學(xué)成分含量的差異。其PCA的負(fù)載因子比圖3B明顯多了1751、1594、1507cm-1等4個(gè)峰，因?yàn)橥粋€(gè)縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的兩面針成分差異更小，需要更多影響因子的作用才能使PCA分析結(jié)果更明顯。同一個(gè)縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)所處的緯度、土壤等外在條件不同，兩面針的化學(xué)成分含量也不同。

以上PCA分析結(jié)果符合實(shí)際情況。

3.3 兩面針不同產(chǎn)地的HPLC比較分析

從廣西不同石山地區(qū)兩面針的紅外光譜比較分析可知，用PCA分析能將不同石山地區(qū)兩面針的樣本在一定程度上進(jìn)行區(qū)分，主要是生物堿和糖類成分的含量存在的差異。兩面針總生物堿中氯化兩面針堿的含量≥60%[13]，采用HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地兩面針中氯化兩面針堿的含量，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，同一縣不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)氯化兩面針堿的含量也存在差異。崇左市所含的氯化兩面針堿含量最高，初步認(rèn)為由于崇左市位于北回歸線以南，光熱充足，濕潤(rùn)多雨，年降雨量達(dá)1200mm以上，全年夏長(zhǎng)冬短，作物一年三熟，所以光合作用的強(qiáng)度較其他產(chǎn)地強(qiáng)，凈光合速率較快，從而含量明顯比其他產(chǎn)地高。大新縣城屬桂西南巖溶山區(qū)，地勢(shì)北高南略低，地形以巖溶石山為主，氣溫比其他產(chǎn)地低，其兩面針中氯化兩面針堿的含量也就明顯比其他產(chǎn)地低?？梢姡煌降貐^(qū)兩面針的HPLC分析結(jié)果與紅外光譜分析結(jié)果相符合。

表1 不同產(chǎn)地兩面針中氯化兩面針堿的含量（mg·g-1）Tab1 Content of nitidine chloride in Z.nitidum from different producing areas（mg·g-1）

4 討論

運(yùn)用FTIR技術(shù)可知兩面針主要含有生物堿、酯類、醇類、苷類、多糖類等化學(xué)成分。用PCA法在一定程度上可將廣西不同石山地區(qū)的兩面針紅外光譜進(jìn)行區(qū)分。不同縣的主要差異反映在糖類物質(zhì)的含量不同；不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的區(qū)分主要反映在生物堿和糖類物質(zhì)的含量不同。通過(guò)HPLC法分析可知崇左市的生物堿含量高于其他縣城，而大新縣城的生物堿含量最低。同一縣的不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)生物堿含量也存在差異。由于樣本所處的地理位置、緯度、氣候、年降雨量、土壤等外在條件的不同，造成兩面針化學(xué)成分含量存在差異。綜上所述，運(yùn)用FTIR技術(shù)可以快速鑒別出不同石山地區(qū)兩面針主要化學(xué)成分的差異，與HPLC法相比具有無(wú)需提取分離，并可以同時(shí)測(cè)定多種化學(xué)成分含量等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確把握藥材的整體信息，避免了用單一成分來(lái)衡量藥材質(zhì)量的優(yōu)劣，更加符合中醫(yī)辨證原理。

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Comparative Analysis of Chemical Compositions ofZanthoxylum nitidumin the Karst Region of Guangxi by HPLC and FTIR

ZHENG Juan-mei，HUANG Shu-shi
（Biophysics Laboratory，Guangxi Academy of Sicence，Nanning 530007，China）
ZHENG Juan-mei，WEI Wen-jun，LEI Xin-chao
（Guangxi College of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530001，China）
WEI Liu-hua，SHEN Liang
（College of Agronomy，Guangxi University，Nanning 530005，China）

OBJECTIVE：To investigate the infrared spectra characteristics and the difference ofZanthoxylum nitidumin the Karst region of Guangxi，and to analyze the difference of alkaloid inZ.nitidumin the Karst region of Guangxi by HPLC.METHODS：Z.nitidumin the Karst region of Guangxi was collected to prepare FTIR spectra.Principal component analysis（PCA）was used to study the difference of spectra.The content of nitidine chloride was determined by HPLC.RESULTS：The differences of chemical compositions ofZ.nitidumin the Karst region due to the diversity of geography，latitude，climate，annual rainfall and soil.CONCLUSION：FTIR can be used to identify the differences of chemical compositions ofZ.nitidumin the Karst region rapidly，and can reflect the general information of medicinal materials accurately.

Zanthoxylum nitidum；FTIR；HPLC；Karst region；Nitidine chloride

R284.1；R927

A

1001-0408（2011）19-1785-04

Δ廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目資助課題（桂科攻0992003A-20）。

＊碩士研究生。研究方向：藥物新制劑、新劑型的研制與開發(fā)。E-mail：jancemm@gmail.com

#通訊作者：副研究員。研究方向：生物物理。電話：0771-2503990。E-mail：hshushi@gxas.cn

2010-06-02

2010-09-06）