微波法制備殼聚糖研究

張 潔，史勁松，孫達(dá)峰，朱昌玲

(1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京210042;2.江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，江蘇 無錫214122)

殼聚糖(chitosan)是甲殼素(chitin)部分脫乙酰化產(chǎn)物，是2－氨基－2－脫氧－D－葡萄糖單體以β(1→4)苷鍵連接而成的直鏈多糖［1］。殼聚糖可溶于大多數(shù)有機(jī)酸和無機(jī)酸的水溶液中。與甲殼素相比，殼聚糖的溶解性和反應(yīng)活性有很大提高。作為一種天然的堿性多糖，殼聚糖無毒，有良好的生物相容性和降解性，因而被用于醫(yī)學(xué)、食品及食品添加劑、日化產(chǎn)品、污水處理［2］和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域［3，4］。盡管殼聚糖的市場需求量大，但是工業(yè)生產(chǎn)方法相對落后。目前主要的生產(chǎn)方法包括熱堿降解法［1］和酶解法［5］。熱堿降解法是用濃堿液浸泡甲殼素，在高溫條件下，經(jīng)過長時間處理，制備殼聚糖。生產(chǎn)過程對設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，并對環(huán)境造成很大污染。而且，熱堿降解法對殼聚糖的糖苷鍵破壞嚴(yán)重，所得產(chǎn)品易降解，粘均分子量較小，分子量分布過寬。酶解法是一種清潔的、條件溫和的生產(chǎn)方法，但是成本高，難于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，尋找高效高產(chǎn)的殼聚糖生產(chǎn)方法仍是目前研究的焦點之一。隨著微波技術(shù)的發(fā)展，有研究者提出利用微波加熱制備殼聚糖［6－9］。

微波是位于光波和無線電波之間的電磁波，頻率在0.3 ～300 GHz之間［10］。微波具有高效、均勻、節(jié)能、環(huán)保等優(yōu)點，應(yīng)用涉及化學(xué)合成、分析化學(xué)、石油化工、礦物冶金、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域［11－14］。與傳統(tǒng)加熱方法相比，微波加熱可以顯著縮短反應(yīng)時間，減少副反應(yīng)，提高產(chǎn)率，改善反應(yīng)的重現(xiàn)性。

本文研究了微波條件下甲殼素脫乙酰反應(yīng)。著重考察了NaOH濃度和微波加熱時間對微波場中甲殼素非均相堿法脫乙酰反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

甲殼素由揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司提供，經(jīng)過粉碎，并過100目篩;NaOH、HCl、冰醋酸等均為國產(chǎn)化學(xué)純試劑。

1.2 主要儀器

微波爐:美的MM720FC8－PS，額定輸出功率700 W;NDJ－5S型旋轉(zhuǎn)粘度計:上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司;FT－IR 360紅外光譜儀:美國Nicolet公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 甲殼素微波脫乙酰反應(yīng)

稱取10.00 g甲殼素，置于500 mL聚四氟乙烯燒杯中。向燒杯中加入濃NaOH溶液，攪拌均勻后，靜置10 min。甲殼素與NaOH溶液的體積比為1∶8［15］。將甲殼素與NaOH混合溶液置于微波爐中，利用微波加熱混合物。反應(yīng)結(jié)束后，洗去產(chǎn)物中過量的堿，得到殼聚糖粗產(chǎn)物。

1.3.2 殼聚糖的提純

用5%HCl溶液溶解殼聚糖粗產(chǎn)物。殼聚糖完全溶解之后，抽濾，除去溶液中的不溶物。所得濾液用30%NaOH溶液調(diào)節(jié)至堿性，使殼聚糖析出。洗滌析出的殼聚糖，除去產(chǎn)品中多余的離子。直至產(chǎn)品的pH值為中性，并用AgNO3試劑檢測濾液中殘余的Cl－。在60℃，將提純后的殼聚糖產(chǎn)品烘干至恒重。

1.3.3 殼聚糖脫乙酰度的測定

按照中華人民共和國水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SC/T 3403－2004)，用電導(dǎo)法測定殼聚糖的脫乙酰度。準(zhǔn)確稱取殼聚糖0.2000 g，倒入250 mL錐形瓶中，加入20 mL 0.100 0 mol/L鹽酸。將錐形瓶置于電磁攪拌器座上，在20℃下攪拌至殼聚糖溶解，再加入50 mL蒸餾水。用0.1000 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定上述殼聚糖溶液。每滴加0.4 mL NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄一次電導(dǎo)率，并做電導(dǎo)率－NaOH溶液體積曲線。殼聚糖的脫乙酰度按下式計算

式中:DD—殼聚糖的脫乙酰度，%;C—NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;ΔV—電導(dǎo)率保持恒定時，滴定用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL;m——殼聚糖樣品質(zhì)量，mg;W—殼聚糖樣品中的水分含量，%;203—甲殼素相對分子質(zhì)量;42—乙?；鄬Ψ肿淤|(zhì)量。

1.3.4 殼聚糖溶液黏度的測定

稱取殼聚糖樣品3.000 g，溶于300 mL 1%醋酸溶液，置于25℃水浴中。待溶解完全后，用NDJ－5S型旋轉(zhuǎn)粘度計測定溶液黏度(1號轉(zhuǎn)子，設(shè)定轉(zhuǎn)速60 r/min，25 ℃)。

1.3.5 殼聚糖的紅外光譜

105℃下烘干殼聚糖，采用KBr壓片法測定樣品在400～4 000 cm－1的紅外光譜。

1.3.6 殼聚糖的粘均分子量

使用烏氏粘度計，采用一點法，以0.1%的醋酸為溶劑，殼聚糖溶液濃度為0.01%，在25℃測定殼聚糖溶液的流出時間。按照經(jīng)驗公式求得溶液的特性粘度［η］

其中ηsp=(t/t0)－1;ηr=t/t0;t為殼聚糖溶液流出時間;t0為溶劑流出時間;Cchitosan為殼聚糖溶液濃度(g/mL);

2 結(jié)果與討論

在一定溫度下，甲殼素固體與濃堿溶液反應(yīng)，脫去乙酰基，得到殼聚糖。由于反應(yīng)發(fā)生在固相與液相之間，反應(yīng)過程中物質(zhì)的擴(kuò)散及傳遞存在一定困難。在常規(guī)加熱條件下，甲殼素非均相堿法脫乙酰反應(yīng)屬于一級化學(xué)反應(yīng)［16－17］。但是采用微波加熱，并在敞口容器中進(jìn)行的甲殼素脫乙酰反應(yīng)受到反應(yīng)溫度和NaOH溶液濃度的影響，反應(yīng)過程比較復(fù)雜。在加熱過程中，堿液中的水分揮發(fā)，NaOH溶液濃度不斷增大。此時，反應(yīng)不符合一級化學(xué)反應(yīng)的規(guī)律［18］。堿溶液的濃度和微波加熱時間是影響殼聚糖脫乙酰度的重要因素。

2.1 NaOH溶液濃度對甲殼素脫乙酰反應(yīng)的影響

取濃度分別為40%、45%、50%、55%的NaOH溶液，與甲殼素混合，置于微波爐中，固定微波加熱時間為30 min，制備殼聚糖。所得殼聚糖經(jīng)過處理后，測定殼聚糖的脫乙酰度(DD)和粘均分子量(Mr)。將殼聚糖溶于1% 醋酸溶液中，測定溶液的黏度(η)。

表1 NaOH溶液濃度(CNaOH)與殼聚糖的脫乙酰度(DD)、粘均分子量(Mr)和溶液黏度(η)的關(guān)系

由上表可知，固定微波加熱時間，隨NaOH溶液濃度增加，殼聚糖的脫乙酰度先增加，后減小，NaOH溶液濃度為45%時，殼聚糖的脫乙酰度最大。用不同濃度NaOH溶液制備的殼聚糖的粘均分子量相近，其1%醋酸溶液的黏度均為60 mPa·s。

在強(qiáng)堿性溶液中，甲殼素不僅直接與濃堿發(fā)生脫乙酰反應(yīng)，生成殼聚糖［1］;而且OH－和水分子可以進(jìn)入甲殼素分子，使大分子溶脹，分子體積增大，柔度增大，N－乙?；芄舻膸茁试黾?。殼聚糖分子在強(qiáng)堿性溶液中可能發(fā)生分子鏈斷裂，分子量降低［19］。NaOH溶液濃度增大，對甲殼素脫乙酰反應(yīng)與殼聚糖降解反應(yīng)都有利。最終所得殼聚糖的脫乙酰度和分子量大小，是兩個反應(yīng)競爭的結(jié)果。本文所得殼聚糖的粘均分子量較大，其1% 醋酸溶液的黏度較高，甲殼素脫乙酰反應(yīng)占主要地位。

限于已有的實驗條件，本文采用普通微波爐加熱反應(yīng)混合物。普通微波爐采用磁鐵開關(guān)循環(huán)控制的脈沖加熱和多模設(shè)計產(chǎn)生的不均勻場，不能精確地控制反應(yīng)溫度和加熱時間，缺少壓力控制和對反應(yīng)混合物的攪拌方法［10］。微波進(jìn)入爐腔后，通過腔壁的反射，以無序方式與樣品相互作用。多模爐腔內(nèi)部可能出現(xiàn)具有不同能量密度的多重能量小區(qū)域，產(chǎn)生了熱點和冷點。盡管微波發(fā)射的功率很高，但是微波場中的功率密度通常較低，空腔內(nèi)能量分布不均勻。如果此時不能對反應(yīng)體系施加有效地攪拌，僅依靠自發(fā)地傳導(dǎo)和對流傳遞熱量，熱量傳遞效率低，分布不均勻。體系內(nèi)部不同位置的反應(yīng)溫度不同，反應(yīng)速度也有區(qū)別。本文采用未經(jīng)任何改裝的普通微波爐，反應(yīng)過程中不能對甲殼素與NaOH溶液混合物進(jìn)行有效地攪拌。微波加熱下，甲殼素與NaOH濃溶液的混合物中可能存在熱量不同的小區(qū)域。熱點和冷點之間熱量交換效率降低，冷點的熱力學(xué)效應(yīng)不明顯。而且隨著NaOH溶液濃度升高，黏度增加，NaOH與甲殼素粉末混合不均勻。甲殼素脫乙酰反應(yīng)的速率整體降低。因此，盡管NaOH溶液濃度增加有利于脫乙酰反應(yīng)，使殼聚糖脫乙酰度增大;但是NaOH溶液濃度高于45%后，殼聚糖的脫乙酰度減小。

2.2 微波加熱時間對甲殼素脫乙酰反應(yīng)的影響

普通微波爐的微波輸出功率不會直接變化，只能通過微波發(fā)射的通/斷轉(zhuǎn)換進(jìn)行火力調(diào)節(jié)。本文所使用微波爐的額定輸出功率為700 W。固定NaOH溶液濃度為45%，改變對甲殼素和NaOH溶液施加微波的時間(t)，測定殼聚糖的脫乙酰度，及其1%醋酸溶液的黏度?？疾煳⒉訜釙r間對甲殼素脫乙酰反應(yīng)的影響。

表2 微波加熱時間對殼聚糖的脫乙酰度(DD)、粘均分子量(Mr)和溶液黏度(η)的影響

實驗表明，隨微波加熱時間增加，殼聚糖的脫乙酰度增大，而其1%醋酸溶液的黏度略有減小。微波加熱的最佳時間為30 min。加熱時間繼續(xù)增加，殼聚糖變黑。加熱時間對殼聚糖的粘均分子量影響不大。本文中微波加熱的時間比文獻(xiàn)中報道的時間長，是因為這里采用間歇加熱的方式，控制反應(yīng)體系的溫度低于110℃。

本文所使用的微波爐的工作頻率為2.45 GHz，這也是絕大多數(shù)微波反應(yīng)器的工作功率。2.45 GHz(1.6×10－3eV)的微波光子能量不足以斷開分子中的共價鍵，甚至低于布朗運動所需的能量［10］。微波不是通過反應(yīng)底物或介質(zhì)直接吸收電磁波能量來誘導(dǎo)化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行。通常認(rèn)為微波可能通過三種途徑影響化學(xué)反應(yīng)速率:單純的熱力學(xué)效應(yīng)、微波介電加熱效應(yīng)和非熱微波效應(yīng)［10，12，16］。對于大多數(shù)化學(xué)反應(yīng)來說，溫度升高有利于反應(yīng)進(jìn)行，反應(yīng)速率的提高只是單純的熱力學(xué)效應(yīng)。不論是采用微波加熱還是傳統(tǒng)的加熱方法，只要能夠達(dá)到極高的溫度，化學(xué)反應(yīng)都能以相同的反應(yīng)速率進(jìn)行，而不存在任何特殊的或非熱的效應(yīng)。微波介電加熱的本質(zhì)仍屬于熱效應(yīng)，但是其促進(jìn)化學(xué)轉(zhuǎn)化率的效果是常規(guī)加熱無法達(dá)到或重復(fù)的。微波介電加熱主要通過“偶極極化作用”和“離子傳導(dǎo)作用”實現(xiàn)［10，12］。偶極極化作用，是指具有偶極矩的物質(zhì)受到微波照射時，物質(zhì)的偶極在電場作用下進(jìn)行排列;當(dāng)電場發(fā)生振蕩時，偶極場試圖在交流電場中進(jìn)行重排;在這個過程中，由于分子間的摩擦和介電損失，能量以熱的形式被消耗。離子傳導(dǎo)機(jī)理，即反應(yīng)體系中溶解的帶電粒子在微波場中前后振蕩，與相鄰的分子或原子相互碰撞，碰撞引起攪動或運動，形成了熱。反應(yīng)體系中通過離子傳導(dǎo)機(jī)理產(chǎn)生的熱量要高于通過偶極極化作用產(chǎn)生的熱量。在上述情況之外，所有不能用單純的熱力學(xué)效應(yīng)或者特殊微波效應(yīng)解釋的，微波場對化學(xué)轉(zhuǎn)化率的提高，稱為非熱微波效應(yīng)。關(guān)于非熱效應(yīng)存在較大爭議。

微波場中，甲殼素脫乙酰反應(yīng)速度加快，已經(jīng)不能用單純的熱力學(xué)效應(yīng)來解釋。代養(yǎng)勇等人比較了傳統(tǒng)的熱堿法和微波加熱法制備殼聚糖，在反應(yīng)時間、殼聚糖的得率和品質(zhì)的區(qū)別［20］。結(jié)果證明，與傳統(tǒng)加熱方法相比，微波加熱不僅顯著縮短反應(yīng)時間，同時避免了長時間高溫處理所導(dǎo)致殼聚糖的分子量和溶液黏度急劇下降，提高了產(chǎn)物的品質(zhì)。微波場中，甲殼素脫乙酰反應(yīng)中存在微波介電加熱效應(yīng)。微波對反應(yīng)體系中的極性水分子發(fā)生偶極極化作用，對帶正電的Na+離子和帶負(fù)電的OH－離子發(fā)生離子傳導(dǎo)作用。NaOH濃度越高，反應(yīng)體系的溫度升高得越迅速。反應(yīng)體系的溫度升高，甲殼素脫乙酰化反應(yīng)的速度加快。但是反應(yīng)溫度過高，殼聚糖的顏色變黑。施加微波的時間越長，混合物的溫度越高，所得殼聚糖的脫乙酰度越大。微波加熱的最佳時間為30 min。時間繼續(xù)增加，殼聚糖變黑。這與文獻(xiàn)中的報道一致［17］。

2.3 殼聚糖的紅外光譜

圖1 固定微波加熱時間為30 min，不同濃度NaOH溶液制備的殼聚糖的紅外光譜

圖2 固定NaOH溶液濃度為45%，微波加熱時間不同，所得殼聚糖的紅外光譜

圖1和圖2為所得殼聚糖的紅外光譜圖。在3 430 cm－1左右為一組寬峰，包括了－OH和－NH3的伸縮振動。2930～2 840 cm－1范圍內(nèi)是各種CH、CH2和CH3的伸縮振動的吸收峰。在2 000 cm－1左右的弱的寬峰是空氣中CO2的雜質(zhì)峰。1 650 cm－1左右為C=O雙鍵的吸收峰，即酰胺Ⅰ。在1 550 cm－1附近的酰胺Ⅱ吸收峰較弱，不如1 310 cm－1左右的酰胺Ⅲ吸收峰明顯。1 420 cm－1附近為=CH2彎曲和－CH3變形吸收峰。1 380 cm－1附近為CH彎曲和－CH3對稱變形吸收峰。1 150 cm－1左右為不對稱氧橋伸縮振動。1 063 cm－1左右為C－O伸縮振動吸收峰。890 cm－1左右為β構(gòu)型殼聚糖的C－H環(huán)伸縮振動吸收峰。實驗所得殼聚糖的紅外光譜圖上的各官能團(tuán)的峰值符合文獻(xiàn)中各官能團(tuán)所屬的振動范圍［1］。

3 結(jié)論

本文采用微波加熱，并在敞口容器中進(jìn)行甲殼素脫乙酰反應(yīng)?？疾炝藟A溶液的濃度和微波加熱時間對殼聚糖脫乙酰度的影響。

首先，固定微波加熱時間為30 min，取濃度(CNaOH)分別為40%、45%、50%、55%的 NaOH溶液，與甲殼素混合，制備殼聚糖。隨NaOH溶液濃度增加，所得殼聚糖的脫乙酰度先增加，后減小。NaOH溶液濃度為45%時，殼聚糖的脫乙酰度最大。不同濃度NaOH溶液所制得的殼聚糖的粘均分子量相近，其1%醋酸溶液的黏度均為60 mPa·s。由于本文采用未經(jīng)任何改裝的普通微波爐，甲殼素與NaOH濃溶液的混合物中可能存在熱量不同的小區(qū)域。混合物中熱點和冷點之間熱量交換效率降低，在冷點的熱力學(xué)效應(yīng)不明顯。而且隨著NaOH溶液濃度升高，黏度增加，NaOH與甲殼素粉末的混合不均勻。因此，對于濃度高于45%的NaOH溶液，隨著濃度增加，甲殼素脫乙酰反應(yīng)的速率整體降低，殼聚糖的脫乙酰度也降低。

第二，固定NaOH溶液濃度為45%，改變微波加熱時間，考察微波對甲殼素脫乙酰反應(yīng)的影響。隨微波加熱時間增加，所得殼聚糖的脫乙酰度增大，而其1%醋酸溶液的黏度略有減小。微波加熱的最佳時間為30 min。加熱時間繼續(xù)增加，殼聚糖變黑。微波加熱時間對殼聚糖的粘均分子量影響不大。微波對甲殼素脫乙酰反應(yīng)的促進(jìn)作用，是單純的熱力學(xué)效應(yīng)和微波介電加熱效應(yīng)共同作用的結(jié)果。

殼聚糖在生產(chǎn)生活中的應(yīng)用廣泛，市場潛力巨大。與熱堿降解法和酶解法相比，微波加熱法制備殼聚糖不僅反應(yīng)速度快，產(chǎn)率高，而且成本較低，可以制備粘均分子量較高的殼聚糖。本文為工業(yè)化微波法制備殼聚糖工藝進(jìn)行了初探。

［1］蔣挺大.殼聚糖［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007:1－67.

［2］Zeng Defang，Wu Juanjuan，Kennedy J F.Application of a Chitosan Flocculant to Water Treatment［J］.Carbohydrate Polymers，2008，71:135－139.

［3］車小瓊，孫慶申，趙 凱.甲殼素和殼聚糖作為天然生物高分子材料的研究進(jìn)展［J］.高分子通報，2008(2):45－49.

［4］Ravi，Kumar M N V.A Review of Chitin and Chitosan Applications［J］.Reactive＆ Functional Polymers，2000，46:1－27.

［5］王 星，郭建生.甲殼素生物脫乙酰技術(shù)研究現(xiàn)狀［J］.現(xiàn)代紡織技術(shù)，2007(2):51－54.

［6］Ge Huacai，Luo Dengke.Preparation of Carboxymethyl Chitosan in Aqueous Solution under Microwave Irradiation［J］.Carbohydrate Research，2005，340:1351－1356.

［7］Ge Huacai，Pang Wan，Luo Dengke.Graft Copolymerization of Chitasan with Acrylic Acid under Microwave Irradiation and its Water Absorbency［J］.Carbohydrate Research，2006，66:372－378.

［8］Yu Jingang，Huang Kelong，Tang Jinchun，et al.Rapid Microwave Synthesis of Chitosan Modified Carbon Nanotube Composites［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2009，44:316－319.

［9］Liu Li，Li Yeping，Li Yu，etc.Rapid N－phthaloylation of Chitosan by Microwave Irradiation ［J］.Carbohydrate Polymers，2004，57:97－100.

［10］Kappe C O，Alexander S.Microwaves in Organic and Medicinal Chemistry［M］.Weinheim:WILEY－VCH Verlag GmbH＆Co KGaA，2005:1－94.

［11］劉玉婷，周 英，尹大偉，等.微波技術(shù)在化學(xué)化工上的應(yīng)用［J］.化學(xué)世界，2010，8:505－508.

［12］童 星，肖小華，鄧建朝，等.低溫微波技術(shù)在化學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.化學(xué)進(jìn)展，2010，22(12):2462－2468.

［13］張忠海，李建波，袁偉忠，等.微波技術(shù)在生物可降解聚合物合成中的研究進(jìn)展［J］.高分子通報，2010(6):47－52.

［14］祁 強(qiáng)，李 萍，張起凱，等.微波技術(shù)的最新應(yīng)用進(jìn)展［J］.化工科技，2009，17(1):60－65.

［15］李巧霞，宋寶珍，仰振球，等.微波間歇法快速制備高粘均分子量和高脫乙酰度的殼聚糖［J］.過程工程學(xué)報，2006，6(5):789－793.

［16］張子濤，陳東輝，陳 亮.甲殼素脫乙?；捌鋭恿W(xué)［J］.青島大學(xué)學(xué)報，2000，15(2):23－26.

［17］劉長霞.甲殼素脫乙?；磻?yīng)動力學(xué)規(guī)律評述［J］.滄州師范?？茖W(xué)校學(xué)報，2002，3:31－33.

［18］李作為，張立彥，曾慶孝.微波場中甲殼素非均相堿法脫乙酰反應(yīng)動力學(xué)研究［J］.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2006，5(2):5－7.

［19］許惠英，李成平，陳雪松，等.微波技術(shù)提取高脫乙酰度高黏度殼聚糖的實驗研究［J］.浙江化工，2006，37(8):3－5.

［20］代養(yǎng)勇，曹 健，王中太.甲殼素傳統(tǒng)法與微波法制備殼聚糖的比較［J］.食品工業(yè)科技，2006，27(6):54－55.