HPLC法測定大鼠肝微粒體中洛伐他汀含量的方法學(xué)研究

姚卓賢，夏宗玲，于鋒

（1.中國藥科大學(xué)，南京市 210009；2.江蘇常州市第一人民醫(yī)院藥劑科，常州市 213001）

HPLC法測定大鼠肝微粒體中洛伐他汀含量的方法學(xué)研究

姚卓賢1，2＊，夏宗玲2，于鋒1#

（1.中國藥科大學(xué)，南京市 210009；2.江蘇常州市第一人民醫(yī)院藥劑科，常州市 213001）

目的：考察測定大鼠肝微粒體中洛伐他汀含量的方法學(xué)。方法：采用高效液相色譜法，內(nèi)標(biāo)為地西泮，色譜柱為UltimateXB-C18，流動相為乙腈-水（70∶30），流速為1.0mL·min－1，檢測波長為238nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL。結(jié)果：大鼠肝微粒體中洛伐他汀檢測濃度的線性范圍為2.5～40μmol·L－1（r＝0.9983），低、中、高濃度洛伐他汀溶液的日內(nèi)RSD分別為5.44%、2.89%、2.83%，日間RSD分別為5.48%、1.84%、1.91%，方法回收率分別為（109.24±3.28）%、（104.82±5.92）%、（102.17±1.92）%，絕對回收率分別為（104.65±2.93）%、（113.72±6.25）%、（101.92±1.89）%。結(jié)論：方法學(xué)考察結(jié)果表明，本方法簡單易行、靈敏度高，可用于肝微粒體中洛伐他汀的含量測定。

高效液相色譜法；洛伐他??；大鼠；肝微粒體；含量測定

他汀類藥物為3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，是目前臨床上廣泛應(yīng)用于調(diào)節(jié)血脂的藥物，占據(jù)了全球調(diào)節(jié)血脂類藥物60%的市場份額[1]。其能使血漿膽固醇濃度降低，并已有文獻(xiàn)[2]證明該類藥物可降低高血脂患者發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險和冠心病患者的死亡率。在動脈粥樣硬化形成的眾多因素中，高血脂與動脈粥樣硬化密切相關(guān)，也是冠心病的獨(dú)立因素[3]。洛伐他?。↙ovastatin）是他汀類降脂藥，該藥物口服吸收后主要分布于肝臟中[4]，經(jīng)肝細(xì)胞色素P450（CYP）同工酶CYP3A4通道代謝成無活性的產(chǎn)物排出體外。近年來，隨著醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展進(jìn)步，多藥聯(lián)用越來越普遍，發(fā)生藥物相互作用及不良反應(yīng)的可能性也隨之增加，為此，筆者建立了在大鼠離體肝微粒體中測定洛伐他汀含量的方法并進(jìn)行了方法學(xué)考察。雖然沒有對大鼠肝微粒體中洛伐他汀的含量進(jìn)行測定，但本方法可為其含量測定打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)，包括2996紫外檢測器、1525雙元梯度泵、717自動進(jìn)樣器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；電子分析天平（塞多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，精密度：1×10－5g）；5417R高速臺式離心機(jī)（德國Effendorf公司）；低溫冰箱（日本Sanyo公司）；旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；恒溫振蕩水槽（上海精宏儀器設(shè)備有限公司）；雪花制冰機(jī)（北京長流科學(xué)儀器公司）。

1.2 試藥

洛伐他汀原料藥（浙江省江北藥業(yè)有限公司，批號：090301，純度：96%）；地西泮對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：230-9601，純度：99%）；乙腈（上海試一化學(xué)試劑有限公司，HPLC級，純度：＞99.7%）；水為超純水；枸櫞酸三鈉鹽、枸櫞酸脫氫酶、氧化/還原型輔酶Ⅱ均購于Sigma-Aldrich（上海）試劑公司。

1.3 動物

SD大鼠，♂，體重200～250g，月齡1.5個月，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，合格證號：SCXK（滬）2003-0003。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（70∶30）；檢測波長：238nm；流速：1.0mL·min－1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 洛伐他汀貯備液。精密稱取洛伐他汀原料藥40.45mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。2.2.2地西泮溶液。精密稱取地西泮對照品5.4mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻得216μg·mL－1的地西泮溶液，待用。

2.2.3 再生系統(tǒng)的制備。枸櫞酸三鈉鹽2.8mg、枸櫞酸脫氫酶0.5mg（相當(dāng)于10u）、0.15mol·L－1氯化鎂0.1mL、0.1mol·L－1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）緩沖液（pH7.4）0.9mL，混合，可根據(jù)需要按比例制備一定量，臨用新配。

2.3 微粒體樣品處理[5]

取大鼠離體肝微粒體適量，用新鮮制備的再生系統(tǒng)稀釋成蛋白濃度為1.0mg·mL－1的混懸液，取此混懸液0.2mL，加洛伐他汀貯備液2μL，混勻，加啟動劑（氧化/還原型輔酶Ⅱ的0.1%碳酸氫鈉溶液，終濃度為0.25mmol·L－1/0.1mmol·L－1），放入溫度為37℃的水箱中，孵育20min后取出，加入冰冷的乙腈0.2mL（含10μL地西泮，終濃度為5.4μg·mL－1）沉淀蛋白，渦旋1min，15000r·min－1離心10min，即得樣品溶液。取上清液20μL進(jìn)樣測定。

2.4 色譜行為

取大鼠離體微粒體適量，用新鮮制備的再生系統(tǒng)稀釋成蛋白濃度為1.0mg·mL－1的混懸液，將此混懸液沉淀蛋白后取上清液作為空白肝微粒體；然后在空白肝微粒體混懸液中加入洛伐他汀貯備液2μL、地西泮溶液10μL，再將此混懸液沉淀蛋白后取上清液；將上述2種上清液及樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜。結(jié)果，洛伐他汀與內(nèi)標(biāo)物地西泮的保留時間分別為12.42、6.07min，色譜峰分離良好，且空白肝微粒體中未見雜質(zhì)峰干擾，色譜詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白肝微粒體；B.空白肝微粒體+洛伐他汀+地西泮；C.樣品溶液；1.洛伐他汀；2.地西泮Fig1 HPLC chromatogramsA.blank liver microsome；B.blank liver microsome+lovastatin+diazepam；C.sample solution；1.lovastatin；2.diazepam

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取一定量洛伐他汀貯備液，加甲醇稀釋成含洛伐他汀40、20、10、5、2.5μmol·L－1的系列溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，取20μL進(jìn)樣，記錄色譜。以溶液中待測物洛伐他汀濃度（X）為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為Y＝0.0355X+0.0102（r＝0.9983）。結(jié)果表明，大鼠肝微粒體中洛伐他汀濃度與峰面積比值在檢測濃度2.5～40μmol·L－1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

取一定量洛伐他汀貯備液，加甲醇稀釋成含洛伐他汀3.75、10、30μmol·L－1的溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，取20μL進(jìn)樣，同日內(nèi)重復(fù)測定5次，連續(xù)測定3d，計算洛伐他汀的日內(nèi)RSD和日間RSD。精密度試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab1 Results of precision tes（t±s，n＝5）

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab1 Results of precision tes（t±s，n＝5）

濃度/μmol·L－1 3.751030日內(nèi)精密度測得值/μmol·L－1 4.08±0.00410.38±0.00530.63±0.021RSD/%5.442.892.83日間精密度測得值/μmol·L－1 4.13±0.00810.65±0.00631.25±0.048RSD/%5.481.841.91

2.7 回收率試驗(yàn)

取一定量洛伐他汀貯備液，加甲醇稀釋成含洛伐他汀3.75、10、30μmol·L－1的溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，取20μL進(jìn)樣，每個濃度進(jìn)行5個樣本分析，計算方法回收率（即將所得信號比值代入回歸方程，求得測定值，與加入量比較）及絕對回收率（即測得洛伐他汀和內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值與相同濃度的洛伐他汀和內(nèi)標(biāo)物的純?nèi)芤旱姆迕娣e比值比較），結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab2 Results of recovery test（±s，n＝5）

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝5）Tab2 Results of recovery test（±s，n＝5）

RSD/%2.995.641.87加入量/μmol·L－1 3.751030測得值/μmol·L－1 4.09±0.1210.48±0.5930.74±0.58絕對回收率x/%104.65±2.93113.72±6.25101.92±1.89RSD/%2.805.491.86方法回收率x/%109.24±3.28104.82±5.92102.17±1.92

2.8 穩(wěn)定性考察

制備濃度為3.75、10、30μmol·L－1的洛伐他汀溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后，將樣品放置在室溫及4℃冰箱內(nèi)，于0、1、5、24、30、48、72h分別進(jìn)樣分析。結(jié)果，RSD均＜5.41%，表明樣品溶液在室溫及4℃下放置72h內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

有文獻(xiàn)[6]報道，以乙腈-磷酸為流動相采用線性梯度洗脫法測定洛伐他汀的含量，但此法操作比較煩瑣，不利于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室測定。筆者分別嘗試使用甲醇-水＝50∶50、70∶30，以及乙腈-水＝50∶50、70∶30作為流動相進(jìn)行測定，結(jié)果表明，當(dāng)乙腈-水＝70∶30為流動相時，色譜分析在14min內(nèi)完成，洛伐他汀、內(nèi)標(biāo)物和雜質(zhì)分離完全，可用于大鼠肝微粒體中洛伐他汀的含量測定。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，本文所建立的肝微粒體中洛伐他汀含量的測定方法，簡單易行，靈敏度高，具有可操作性，便于在臨床上推廣應(yīng)用。

[1]蔡德山.“他汀類”調(diào)血脂藥物市場分析[J].中國醫(yī)藥技術(shù)經(jīng)濟(jì)與管理，2008，2（7）：9.

[2] 龐國強(qiáng).他汀類藥物的藥理與臨床應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，7（1）：11.

[3] 王忠全，丁卓玲.4種他汀類藥物治療高血脂癥成本-效果分析[J].中國藥房，2007，18（26）：2008.

[4] 鄧萬俊.他汀類藥物與其他藥物的相互作用[J].中國新藥與臨床雜志，2006，25（2）：131

[5] 夏宗玲，許建平，鄒素蘭.探針?biāo)幬锓y定CYP4503A的活性[J].藥學(xué)與臨床研究，2010，18（2）：142.

[6] 張西如，高燕霞，姜建國.RP-HPLC測定洛伐他汀及片劑的有關(guān)物質(zhì)[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2009，26（13）：1148.

Methodological Study of Content Determination of Lovastatin in Rat Liver Microsomes by HPLC

YAO Zhuo-xian，YU Feng
（China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）
YAO Zhuo-xian，XIA Zong-ling
（Dept.of Pharmacy，Changzhou First People’s Hospital in Jiangsu Province，Changzhou 213001，China）

OBJECTIVE：To investigate the methology of the content determination of lovastatin in rats liver microsomes.METHODS：HPLC method was adopted with diazepam as internal standard.The determination was performed on UltimateXB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（70∶30）at a flow rate of 1.0mL·min－1.The detection wavelength was set at 238nm and column temperature was 30℃.The injection volume was 20μL.RESULTS：The calibration curves of lovastatin were linear in the range of 2.5～40μmol·L－1（r＝0.9983）.The intra-day RSD of lovastatin at low，medium and high concentrations were 5.44%，2.89%and 2.83%，and the inter-day RSD were 5.48%，1.84%and 1.91%，respectively.The relative recoveries were（109.24±3.28）%，（104.82±5.92）%，（102.17±1.92）%，and the absolute recoveries were（104.65±2.93）%，（113.72±6.25）%，（101.92±1.89）%，respectively.CONCLUSION：Results of methological study show that the method is simple，sensitive and suitable for the content determination of lovastatin in rat liver microsomes.

HPLC；Lovastatin；Rat；Liver microsomes；Content determination

R972+.6；R969

A

1001-0408（2011）17-1562-02

＊藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0519-68870866。E-mail：sylvia2819@hotmail.com

#通訊作者：教授，博士。研究方向：臨床藥學(xué)和藥理學(xué)。電話：025-83271299。E-mail：yufengcpu@163.com

2010-07-12

2010-10-10）