應用鼓泡塔式反應器生產(chǎn)藏紅花素的研究

陳書安，王曉東，袁曉凡，趙兵，王玉春

藏紅花（Crocus sativus L.）被譽為“植物黃金”，是一種名貴的婦科良藥，有望成為 21 世紀最理想的抗癌藥物之一[1-3]。但藏紅花種植條件苛刻、適宜栽培的地區(qū)有限、田間栽培過程易感染病毒，加之其柱頭入藥、產(chǎn)量極低，致使其資源短缺、價格昂貴[3-4]。通過植物細胞培養(yǎng)體系生產(chǎn)藏紅花素，是解決藏紅花資源短缺的有效途徑之一[3]，其中生物反應器技術是其實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關鍵技術之一。

為建立藏紅花細胞培養(yǎng)體系，從誘導的 229 株藏紅花愈傷組織中篩選出一株藏紅花素含量高、生長速度快的細胞系[4-5]；經(jīng)脫毒處理，該細胞系無國內外報道的侵染藏紅花的病毒[6]，經(jīng)優(yōu)化建立了其搖瓶培養(yǎng)體系[7-8]。為實現(xiàn)藏紅花素的規(guī)模化生產(chǎn)，選擇鼓泡塔式反應器作為研究的對象，探求其生物反應器培養(yǎng)的參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 藏紅花球莖 1 細胞系，黃色，質地疏松，不透明。

1.1.2 培養(yǎng)基 以 B5（Gamborg，1968）[9]為基本培養(yǎng)基，添加 1 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）、2 mg/L 萘乙酸（NAA）和 300 mg/L 水解酪蛋白，簡稱 M2B5 培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器 UV-2802 紫外可見光檢測器為尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；2.5 L 鼓泡式生物反應器：反應器罐體高 30 cm，直徑為 12 cm。

1.2 方法

1.2.1 生物量的測定方法 將藏紅花細胞懸浮培養(yǎng)液，經(jīng)8000 × g 離心 20 min，取離心沉淀的細胞置于烘箱，60 ℃烘干至恒重，稱其干重即為生物量。

1.2.2 藏紅花素含量測定方法 將藏紅花細胞懸浮培養(yǎng)液，經(jīng) 8000 × g 離心 20 min，回收上清液；將離心沉淀的細胞用 20 ml 50% 的甲醇在室溫下?lián)u床振蕩提取 2 h 后，經(jīng) 8000 × g 離心 20 min，回收上清液；將二次離心沉淀的細胞再用 10 ml 50% 的甲醇在室溫下?lián)u床振蕩提取 1 h，8000 × g 離心 20 min，回收上清液。合并上述三次離心回收的上清液，經(jīng)真空濃縮直至 1 ml 以下，膜（0.22 μm）過濾后用 HPLC 測定。藏紅花素的檢測色譜柱：Nucleosil C18（3.9 mm × 150 mm，5 μm 粒度）；紫外可見光檢測器（波長范圍：190 ～ 800 nm）；檢測波長：440 nm；流動相：53% 甲醛溶液；流速：0.7 ml/min，進樣量：10 μl。

1.2.3 NO3-、NH4+、PO43-濃度的測定方法 NO3-濃度的測定方法見文獻[10]；NH4+濃度的測定方法見文獻[11]；PO43-濃度的測定方法見文獻[12]。

2 結果

2.1 通氣量對藏紅花細胞懸浮培養(yǎng)的影響

鼓泡式生物反應器結構簡單、剪切力較小、操作簡易、不易染菌，在植物細胞培養(yǎng)中被較廣應用。在 2.5 L 鼓泡式生物反應器中接種鮮重為 100 g 的藏紅花細胞，控制不同的通氣量，在 2 L M2B5 液體培養(yǎng)基中（22 ± 1）℃ 全時暗培養(yǎng) 28 d 后，細胞的生物量和藏紅花素的產(chǎn)量如圖 1所示。

圖 1 通氣量對鼓泡式生物反應器中藏紅花細胞生長和藏紅花素累積的影響

從圖 1 可見，氣流量對藏紅花細胞的懸浮培養(yǎng)影響較大，在一定范圍內，隨著通氣量的增加，細胞的生物量和藏紅花素的產(chǎn)量也在增加。當通氣量為 0.015 m3/h 時，細胞生長最快，生物量達到最高，為 8.6 g/L；藏紅花素的產(chǎn)量也達到最高，為 0.44 g/L；與生物量相對應，細胞的增長倍數(shù)也達到最高，為 3.2 倍。若通氣量繼續(xù)增加，細胞的生物量和藏紅花素的產(chǎn)量均下降，如當通氣量為 0.03 m3/h時，細胞的生物量、細胞增長倍數(shù)和藏紅花素產(chǎn)量分別降至6.1 g/L、2.3 倍和 0.32 g/L。

在植物細胞的懸浮培養(yǎng)過程中，通氣量過高或過低均會產(chǎn)生不利影響。過低的通氣量造成培養(yǎng)液中溶氧系數(shù)過低，細胞得不到充分的氧氣，生長受到阻礙；另外，通氣量過低，不利于細胞在反應器內循環(huán)，細胞堆積于反應器底部，得不到充分的營養(yǎng)物質和氧氣的供應，容易褐變死亡。而氣流量過大，細胞在培養(yǎng)液中受到的剪切力過大，嚴重損傷細胞膜，導致細胞溶解；同時，過量的通氣量驅除了培養(yǎng)液中的 CO2和乙烯等對植物細胞生長和次級代謝產(chǎn)物合成有益的氣體，從而抑制植物細胞的生長和次級代謝產(chǎn)物的合成[13-14]。鼓泡式生物反應器的氧傳遞能力一般較大，且高通氣量時，因CO2的排出往往會使植物細胞生長下降而降低了氣體成分的傳質系數(shù)[15-16]，所以在培養(yǎng)藏紅花細胞時，宜采用較低的通氣量，以 0.015 m3/h 為宜。

2.2 通氣量對蔗糖、 消耗的影響

在不同通氣量下，將鮮重為 100 g 的藏紅花細胞接種在 2 L M2B5 液體培養(yǎng)基中，（22 ± 1）℃ 全時暗培養(yǎng) 28 d后，培養(yǎng)液的蔗糖、的濃度變化見圖 2。

圖 2 通氣量對培養(yǎng)液中蔗糖、濃度變化的影響

2.3 接種量對藏紅花細胞懸浮培養(yǎng)的影響

通氣量為 0.015 m3/h，在 2.5 L 鼓泡式生物反應器中按不同接種量接入藏紅花細胞，在 2 L M2B5 液體培養(yǎng)基中（22 ± 1）℃ 全時暗培養(yǎng) 28 d 后，細胞生長和藏紅花素合成的結果見圖 3。

圖 3 接種量對鼓泡生物反應器中藏紅花細胞生長和藏紅花素累積的影響

圖 3 表明在鼓泡塔式反應器中，接種量對細胞的生物量和藏紅花素的產(chǎn)量影響都很大。接種量過小時，細胞生長的延滯期較長，細胞生長緩慢，細胞的生物量和藏紅花素的產(chǎn)量都很低。隨著接種量的增加，細胞的生物量和藏紅花素的產(chǎn)量也隨之增加；但接種量過大，通氣量較小，細胞則易堆積于反應器底部，而且氧供應不充分，供氧速率下降，細胞容易因缺氧而變褐死亡，細胞的生物量和藏紅花素的產(chǎn)量隨之下降。控制通氣量為 0.015 m3/h，當接種量為 5%，細胞生長最快，培養(yǎng) 28 d 后增長 3.2 倍，達到 9.6 g/L，藏紅花素的產(chǎn)量也達到最高，為 0.45 g/L。若接種量繼續(xù)增加，細胞的生物量和藏紅花素的產(chǎn)量未隨之增加，細胞的增長倍數(shù)反而降低。

2.4 接種量對培養(yǎng)液的蔗糖、消耗的影響

通氣量為 0.015 m3/h，將不同接種量的藏紅花細胞接入2 L M2B5 液體培養(yǎng)基中，（22 ± 1）℃ 全時暗培養(yǎng) 28 d 后，培養(yǎng)液的蔗糖、的濃度變化見圖 4。

圖 4 接種量對培養(yǎng)液中蔗糖、濃度變化的影響

圖 4 表明在通氣量為 0.015 m3/h，接種量為 5% 時，培養(yǎng) 28 d 后，培養(yǎng)液中和蔗糖的濃度均達到最低，分別為 1213 mg/L、12.4 mg/L、18.7 mg/L和6.8 g/L，都與藏紅花細胞的最大生物量（9.6 g/L）和藏紅花素的最大產(chǎn)量（0.45 g/L）相對應。

表 1 藏紅花細胞在搖瓶和生物反應器培養(yǎng)的比較

3 討論

生物反應器技術是植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關鍵因素之一。最初植物培養(yǎng)生物反應器大多采用微生物反應器，由于植物細胞與微生物細胞存在很大區(qū)別，因此，必須開發(fā)和選擇適于植物細胞培養(yǎng)的生物反應器。

與搖瓶培養(yǎng)相比，在生物反應器中，植物細胞次級代謝產(chǎn)物的合成能力難以提高，甚至某些時候合成能力喪失。通常造成這種情況的主要原因是植物細胞的個體大，細胞壁僵脆和具有大的液泡，因此在高剪切力下細胞容易被損傷和溶解；但剪切力對植物細胞的影響也有積極方面，如增加通氣，保持細胞良好的混合狀態(tài)和分散性，在合適的條件下可以提高細胞產(chǎn)率和增加次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[17]。因此需要不斷優(yōu)化生物反應器的種類及相關參數(shù)，既能保持細胞的分散性、增加溶解氧，又能減少剪切力副作用。藏紅花細胞在搖瓶和 3 種生物反應器培養(yǎng)的結果比較見表 1。

表 1 表明，與搖瓶培養(yǎng)[8]相比較，藏紅花懸浮細胞在生物反應器培養(yǎng)的生物量比較低，采用鼓泡塔和氣升式反應器培養(yǎng)藏紅花細胞，其藏紅花產(chǎn)量分別是采用搖瓶培養(yǎng)的71.6% 和 72.3%，但采用反應器培養(yǎng)有利于規(guī)?；a(chǎn)藏紅花素。

通過分析藏紅花細胞在 3 種生物反應器的培養(yǎng)結果可知，與導流筒氣升式生物反應器[18]相比，采用鼓泡式生物反應器培養(yǎng) 28 d 后，藏紅花的生物量和藏紅花素的產(chǎn)量沒有明顯差異，但細胞的增長倍數(shù)比較高。與篩網(wǎng)導流筒氣升式生物反應器[18]相比，采用鼓泡式生物反應器培養(yǎng)，藏紅花的生物量和藏紅花素的產(chǎn)量均有提高，鼓泡式生物反應器為植物細胞的生長提供了低剪切力環(huán)境，其結構簡單，氣體從底部通過噴嘴或氣體分布器穿過培養(yǎng)液實現(xiàn)氣體傳遞與物質交換，整個系統(tǒng)密閉，易于無菌操作；培養(yǎng)過程中無需機械能消耗，適于培養(yǎng)藏紅花細胞生產(chǎn)藏紅花素。

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