豚鼠耳石修復(fù)再生的超微結(jié)構(gòu)及SPARC動(dòng)態(tài)變化△

楊蒙生 賈宏博 谷京城 劉振華 穆蘭

耳石是內(nèi)耳前庭橢圓囊和球囊中一種碳酸鈣生物礦物質(zhì)合成物，在空間定向和平衡保持等方面具有重要的作用。然而，外傷、老齡化、耳毒性藥物、內(nèi)耳缺血、微量元素缺乏等諸多因素均可引起耳石在內(nèi)耳的分布、代謝等發(fā)生變化，臨床上常見的老年平衡障礙、良性陣發(fā)性位置性眩暈、外傷后眩暈等也與其密切相關(guān)[1，2]。

盡管耳石和位覺砂有奇特的外形及重要的生理功能，但目前對(duì)其形成及再生卻了解甚少。前庭耳石的再生雖然涉及較多的環(huán)節(jié)，但最主要的首先是有機(jī)基質(zhì)和相關(guān)無機(jī)鹽離子的相互作用問題。有機(jī)基質(zhì)雖然含量較少，但卻與耳石的發(fā)生、代謝和某些病變等關(guān)系重大[3]。研究發(fā)現(xiàn)在斑馬魚和青鳉胚胎期耳內(nèi)均有較強(qiáng)的富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(SPARC)表達(dá)[4，5]，其結(jié)構(gòu)上有與鈣離子高親和力結(jié)合的區(qū)域，而鈣離子是耳石再生過程中一個(gè)非常重要的無機(jī)鹽離子。成熟動(dòng)物前庭終末器官SPARC的分布如何，其在成熟耳石破壞后再生過程中的作用是否與胚胎耳石發(fā)生相似，具體的變化和作用如何，這些尚不十分清楚。

本研究利用機(jī)械力破壞耳石的動(dòng)物模型[6，7]，觀察SPARC在豚鼠成熟耳石破壞后再生過程中的分布和變化情況，以期為進(jìn)一步揭示SPARC在成熟耳石破壞后再生中的作用提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用健康白色紅目豚鼠40只，體重300～400 g，雌雄不限，Preyer’s反射靈敏，鼓膜完整，隨機(jī)分為對(duì)照組(10只，不給予任何刺激)和離心力高過載刺激組(高G組，30只，給予5 min 10 G的離心力刺激)，高G組又分為高G刺激后當(dāng)天、三天和七天組，每組各10只，分別于刺激后即刻(0.5～1小時(shí))、第3天和第7天，對(duì)陽性癥狀者斷頭處死，剝離聽泡并制作冰凍切片。

1.2離心力高過載刺激方法及觀察指標(biāo) 高G組刺激方式[6，7]：利用臂長為2 m的動(dòng)物離心機(jī)，以400 deg/s的速度勻速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生10 G的力場(chǎng)環(huán)境；動(dòng)物右耳向旋轉(zhuǎn)軸心，身體長軸沿旋轉(zhuǎn)軌跡的切線方向與地面平行；頭部通過特制的木盒固定，使其在刺激過程中不會(huì)發(fā)生各方向的位移和體位改變，離心力上升速度為1 G/s,達(dá)到10 G后開始計(jì)時(shí)，4 min后以同樣的加速度值減速，這樣動(dòng)物可受到4 min的+10 G離心力刺激。

刺激完后觀察豚鼠前庭軀體反射，包括有無頭位偏斜、頭位震顫、身體側(cè)斜傾倒、側(cè)滾、原地轉(zhuǎn)圈、行走步態(tài)不穩(wěn)等，以及受刺激后活動(dòng)增強(qiáng)或減弱，神態(tài)變化，反應(yīng)是否靈敏等，記錄其持續(xù)時(shí)間。凡是上述觀察指標(biāo)中出現(xiàn)其中任何一項(xiàng)或一項(xiàng)以上癥狀者記為陽性，為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3電鏡觀察 取造模成功(耳石損傷)后動(dòng)物，快速斷頭處死，取出聽泡，2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液蝸內(nèi)沖洗灌注固定，按常規(guī)掃描電鏡標(biāo)本制備方法準(zhǔn)備，日立SEM-800型掃描顯微鏡下觀察，拍照。

1.4免疫組化SP法染色觀察耳石再生不同階段前庭SPARC的表達(dá) 取造模成功的動(dòng)物于各組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行組織取材固定，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。以細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或黃褐色顆粒為SPARC陽性細(xì)胞。免疫組化切片經(jīng)顯微鏡觀察和照相機(jī)照相后，采用HMIAS21000型高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)測(cè)定各組切片染色的平均灰度值。根據(jù)各組切片染色陽性細(xì)胞率和陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度進(jìn)行免疫組化評(píng)分(ISH)[8]：A為陽性細(xì)胞數(shù)分級(jí)，分為5級(jí)：0～1%=0、 1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4，B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)，分為4級(jí)：0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強(qiáng)陽性)，IHS=A×B。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用方差分析，高G組不同時(shí)間兩兩比較使用Post-Hoc方法。

2 結(jié)果

2.1前庭行為學(xué)表現(xiàn) 高G組豚鼠刺激后有23只動(dòng)物出現(xiàn)陽性癥狀即造模成功，陽性率76.67%(23/30)，當(dāng)天組8只、三天組7只、七天組8只，每組動(dòng)物各種癥狀持續(xù)時(shí)間普遍較短，均在30 min內(nèi)消失。所有癥狀中，以頭位震顫的發(fā)生率最高，其他癥狀出現(xiàn)時(shí)幾乎都伴有頭位震顫。每組各取5只用于檢測(cè)SPARC在內(nèi)耳的表達(dá)觀察，其余用于電鏡觀察。

2.2電鏡下耳石器變化 對(duì)照組未見異常，囊斑表面均勻分布不同大小的耳石，耳石呈現(xiàn)為棱柱體結(jié)構(gòu)，兩端為三棱椎體形，表面光滑，長徑在2～28 μm之間；毛細(xì)胞纖毛排列整齊，無明顯粘連及倒伏(圖1a)。高G組刺激后1 h(當(dāng)天組)囊斑表面出現(xiàn)大量球狀物，在高倍鏡下，可見球狀物主要呈現(xiàn)“線團(tuán)狀”，由大量的纖維纏繞組成球狀結(jié)構(gòu)(圖1b)；刺激后3 d(3天組)除上述原始初期的球狀物外還可以見球狀物逐步發(fā)生礦化，即纏繞的纖維逐步由類似礦物質(zhì)的東西代替和填充(圖1c)；刺激后7 d(7天組)，原始初期的球狀物逐漸減少，礦化的球狀物逐漸增加，此外可見球狀物與耳石共存的現(xiàn)象：在球狀物之間，夾雜新生的小耳石，這些耳石部分呈啞鈴狀，部分在形狀上已與正常成熟耳石無顯著差別(圖1d)。此外，各組均可見到耳石“變性”現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為耳石表面粗糙、出現(xiàn)裂紋以及大量耳石聚集粘合、結(jié)成團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)。

2.3前庭SPARC的表達(dá)情況 結(jié)果顯示，SPARC蛋白在內(nèi)耳均呈現(xiàn)出“多點(diǎn)”表達(dá)的特點(diǎn)，即其并非只在耳石的原位——橢圓囊和球囊囊斑的感覺上皮有表達(dá)，在感覺上皮臨近和相對(duì)位置的非感覺上皮以及壺腹、半規(guī)管和耳蝸等多個(gè)部位均有豐富表達(dá)，在橢圓囊和球囊囊腔、半規(guī)管內(nèi)等也有染色陽性物質(zhì)出現(xiàn)。對(duì)照組前庭囊斑上皮組織細(xì)胞中SPARC有微弱表達(dá)，顯色不清或陽性細(xì)胞呈淺褐色(圖2a)；當(dāng)天組前庭囊斑的支持細(xì)胞、移行細(xì)胞、基底細(xì)胞中表達(dá)量明顯增強(qiáng)，陽性細(xì)胞增多，陽性細(xì)胞染色強(qiáng)(圖2b)；三天組和七天組的豚鼠前庭囊斑的所有細(xì)胞內(nèi)均可見SPARC有較強(qiáng)的表達(dá)(圖2c、d)。各組SPARC免疫組化染色的平均灰度值及IHS評(píng)分見表2，與對(duì)照組相比，當(dāng)天組、三天組和七天組中SPARC的表達(dá)均增加(即平均灰度值減低)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高G組三組間SPARC的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比，其他三組的IHS評(píng)分升高(P<0.05),高G組三組間的評(píng)分比較均逐漸升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組豚鼠囊斑中SPARC的表達(dá)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖1 各組豚鼠囊斑耳石(×2000) a～d依次為對(duì)照組、高G刺激后當(dāng)天組、三天組、七天組

圖2 各組豚鼠囊斑SPARC的表達(dá)(SP×200) a～d依次為對(duì)照組、高G刺激后當(dāng)天組、三天組、七天組

3 討論

本研究采用離心力高過載破壞豚鼠成熟耳石[6，7]，發(fā)現(xiàn)豚鼠出現(xiàn)各種行為癥狀持續(xù)的時(shí)間普遍很短，均在30 min之內(nèi)恢復(fù)正常，此結(jié)果與Ott等對(duì)金魚耳石破壞后觀察的結(jié)果相似[9]，根據(jù)他們的觀點(diǎn)，前庭器官結(jié)構(gòu)上的恢復(fù)時(shí)間不會(huì)這么短，這種代償可能主要是一種功能性的而非結(jié)構(gòu)性的。

前庭耳石器系統(tǒng)由感受線加速度和重力加速度的球囊和橢圓囊組成，囊斑表面有一層耳石膜，由耳石層、膠質(zhì)層和頂下網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，耳石是耳石膜的主要組成部分，所以如果其所處的力場(chǎng)發(fā)生改變(如超重)，會(huì)引起其結(jié)構(gòu)重量等的變化，此已為許多研究所證實(shí)[10]。本實(shí)驗(yàn)電鏡觀察結(jié)果顯示，離心力過載作用會(huì)造成耳石的原形態(tài)消失和耳石的再生——球狀物的出現(xiàn)，隨后球狀物逐步向成熟期轉(zhuǎn)化。分析本實(shí)驗(yàn)條件下(離心力高過載作用)引起上述變化的可能原因是：耳石的比重大約是內(nèi)淋巴的3倍，其與下方的膠質(zhì)層借結(jié)締組織緊密相連，10 G環(huán)境下，其與膠質(zhì)層的剪切力增加，但其與膠質(zhì)層的結(jié)合力并未改變，因此極易發(fā)生脫離移位，因此認(rèn)為高G環(huán)境使耳石與膠質(zhì)層的剪切力成倍增加，從而引起耳石移位和代謝障礙是以上各種結(jié)構(gòu)改變的主要原因，此與頭部外傷時(shí)機(jī)械性外力打擊造成的耳石移位具有某些相似性[11]。此外，不排除其他諸如機(jī)械性作用以及高G作用引起的局部血液循環(huán)障礙等因素的作用。

SPARC是一種具有多種功能的小分子酸性糖蛋白，曾被人們稱作骨連接蛋白、基底膜-40、43K蛋白，是一種分泌性鈣結(jié)合糖蛋白，屬于matricellular蛋白家族[12]，在機(jī)體內(nèi)分布廣泛，能在多種組織細(xì)胞尤其是在那些正在發(fā)育和重建的組織中表達(dá)。其多肽C端有一既可以與細(xì)胞外鈣離子結(jié)合也可以與膠原結(jié)合的區(qū)域，可能對(duì)鈣離子的分泌和聚集起到輔助作用，并且在其內(nèi)部有一類似卵泡抑素的區(qū)域，可能影響其周圍細(xì)胞的增殖、分化和粘附[13]。多肽N端有一與鈣離子高親和力結(jié)合的酸性區(qū)域，可能在成骨和礦化方面起到連接膠原和礦物質(zhì)的作用。2007年在前庭耳石器中發(fā)現(xiàn)了SPARC-like 1, countertrypin, and fetuin-A等蛋白，未能確定其作用[14，15]也說明其可能與前庭耳石器之間存在一定的關(guān)系。

目前對(duì)SPARC在前庭的研究多集中于胚胎期動(dòng)物的研究，Rotllant等[16]最近用斑馬魚研究發(fā)現(xiàn)SPARC是咽部軟骨及內(nèi)耳形成后期階段所必須的有機(jī)物；Kang等[17]敲除SPARC基因后，動(dòng)物耳石在大小、形狀、數(shù)量上出現(xiàn)不同程度的改變以及表現(xiàn)為行為和姿態(tài)的障礙。以上均說明SPARC可能在耳石發(fā)生中起很重要的作用，但對(duì)其在成熟耳石中如何表達(dá)以及在成熟耳石破壞后的表達(dá)部位和強(qiáng)度變化如何等研究卻較少。本研究結(jié)果顯示高G組SPARC的表達(dá)部位與對(duì)照組相比并無顯著變化，但強(qiáng)度上有差異，離心力高過載刺激后各組在耳石再生過程中，支持細(xì)胞、毛細(xì)胞中SPARC的表達(dá)量顯著增加，并且在一周內(nèi)，隨著離心力高過載刺激后時(shí)間的延長，SPARC在前庭囊斑中的表達(dá)相應(yīng)增強(qiáng)。結(jié)合形態(tài)學(xué)的改變說明耳石從球形向菱形體和柱狀體逐漸轉(zhuǎn)化的過程中，SPARC的表達(dá)呈逐漸增加的趨勢(shì)。從SPARC蛋白的分布特點(diǎn)以及其表達(dá)趨勢(shì)來看，推測(cè)其對(duì)增加球狀物內(nèi)部的Ca2+濃度以及啟動(dòng)耳石核心的CaCO3結(jié)晶化方面有很重的作用，提示SPARC與球狀物逐步成熟、發(fā)生礦化形成成熟耳石的過程有關(guān)，即耳石的礦化過程需要大量SPARC等有機(jī)物的參與來引起CaCO3結(jié)晶化合融合。但SPARC在耳石再生過程中的具體作用目前尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

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