多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)選紅花提取液醇沉工藝

袁 佳,李頁瑞,陳 勇,王龍虎,劉雪松

多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)選紅花提取液醇沉工藝

袁 佳,李頁瑞,陳 勇,王龍虎,劉雪松

(浙江大學(xué)藥學(xué)院,浙江杭州 310058)

目的：研究并確定紅花提取液的最佳醇沉工藝。方法：以羥基紅花黃色素 A(HSYA)轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn),分別考察終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、攪拌速度、藥液初始質(zhì)量濃度、醇沉溫度和藥液 pH等因素的影響。選取對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果影響較大的 4個(gè)因素,采用 L9(34)正交試驗(yàn)法,以HSYA轉(zhuǎn)移率、浸出物得率和純度為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分,確定紅花提取液醇沉的最佳工藝條件。結(jié)果：紅花提取液的最佳醇沉工藝條件為終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) 50%,藥液初始質(zhì)量濃度 1.15 g/ml,攪拌速度 500 r/min,藥液 pH 5.0。結(jié)論：優(yōu)選的工藝操作簡便、穩(wěn)定,HSYA轉(zhuǎn)移率、浸出物得率和純度較高。

紅花 /分離和提純;沉淀;正交試驗(yàn);中藥制藥工藝 /方法

[J Zhejiang Univ(Medical Sci),2011,40(1)：27-32.]

紅花為菊科植物紅花 (Carthamus tinctorius L.)的干燥花,性味辛溫,具有活血通經(jīng)、散瘀止痛功效[1]。紅花主要含查耳酮類、黃酮類、酚酸、脂肪酸、揮發(fā)油、聚炔等化學(xué)成分[2],主要活性組分之一是紅花黃色素 (safflower yellow,SY),其中以羥基紅花黃色素 A(hydroxy safflower yellow A,HSYA)含量最高。研究表明,HSYA具有降壓、擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集及抗凝、抗氧化、抗腫瘤和腦保護(hù)等作用[3]。因此,開發(fā) HSYA系列制劑及產(chǎn)品,對(duì)提高人民的健康水平具有重要意義。為提高紅花制劑的療效,富集純化 HSYA至關(guān)重要,其中醇沉過程是關(guān)鍵步驟之一。近年來,對(duì)水溶性的 HSYA常利用大孔吸附樹脂進(jìn)行分離純化[4-5],但純度不高。目前,關(guān)于紅花水提液醇沉工藝的研究報(bào)道較少,而且已有報(bào)道對(duì)考察的影響因素不夠全面,評(píng)價(jià)指標(biāo)較為單一[6]。本研究在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,結(jié)合正交試驗(yàn)和多指標(biāo)綜合評(píng)分法對(duì)紅花提取液的醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)化研究,考察因素和評(píng)價(jià)指標(biāo)較全面,在實(shí)驗(yàn)條件下優(yōu)選出的醇沉工藝具有 HSYA轉(zhuǎn)移率高、浸出物得率和純度高等優(yōu)點(diǎn),有廣泛的工業(yè)化應(yīng)用前景。

1 材 料

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀配置四元泵、在線脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器、柱溫箱和 Chemstation工作站;JJ-1增力電動(dòng)攪拌器為金壇市杰瑞爾電器有限公司產(chǎn)品;METTLER-AE240型電子天平為上海梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品,THD-06Q低溫恒溫槽為寧波天恒儀器廠產(chǎn)品。

1.2 試藥 紅花提取液 (天津紅日藥業(yè)股份有限公司,藥液質(zhì)量濃度 1.182 g/ml)、羥基紅花黃色素 A對(duì)照品 (成都曼斯特生物科技有限公司,批號(hào) A0803)、色譜純甲醇 (Merck,Germany),色譜純乙腈 (Merck,Germany)、Millipore超純水,其余試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 紅花藥液的配制 取紅花提取液適量,加水稀釋,用密度計(jì)測(cè)量,分別配制成質(zhì)量濃度為1.15 g/ml、1.10 g/ml、1.05 g/ml和 1.00 g/ml的紅花藥液。

2.2 醇沉工藝操作 實(shí)驗(yàn)過程在潔凈燒杯中進(jìn)行,精密量取 10 ml紅花藥液,在攪拌下往藥液中勻速加入 95%乙醇,乙醇加完后將燒杯封口,靜置冷藏 24 h,取上層清液測(cè)定 HSYA含量。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB C18柱 (4.6 mm ×250 mm,5μm);流動(dòng)相 ：甲醇 -乙腈-0.7%磷酸溶液 (26∶2∶72,V/V/V);流速：0.7 ml/min;檢測(cè)波長：403 nm;柱溫：30℃;進(jìn)樣量 ：10μl。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取 3.50 mg羥基紅花黃色素 A對(duì)照品,置 5 ml量瓶中,加20%乙腈-水 (V/V)溶解并定容至刻度,分別稀釋配制成質(zhì)量濃度為 350μg/ml、175μg/ml、140μg/ml、70μg/ml、35μg/ml、17.5μg/ml的對(duì)照品溶液,按“2.3.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積。以峰面積為橫坐標(biāo) (X),濃度為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得曲線的回歸方程為 Y=0.0319X-0.5179,R2=0.9996,表明 HSYA在 0.175～3.5μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 供試品溶液含量測(cè)定 按正交試驗(yàn)條件進(jìn)行醇沉實(shí)驗(yàn),醇沉后的藥液靜置冷藏 24 h,取上清液 1.0 ml置 25 ml量瓶中,加純水定容,經(jīng) 0.45μm微孔濾膜,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件,測(cè)定 HSYA含量。

2.3.4 HSYA轉(zhuǎn)移率 計(jì)算方法：

2.4 浸出物得率和純度計(jì)算 精密量取各試驗(yàn)中所用初始藥液和醇沉后藥液各 10 ml,置已干燥恒重的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干后置 105℃干燥箱中干燥至恒重,然后取出,冷卻 30 min,迅速精密稱重,分別得初始浸膏質(zhì)量和醇沉后浸膏質(zhì)量,每個(gè)試驗(yàn)樣品平行測(cè)定 3份,取平均值,計(jì)算浸出物得率和純度。

2.5 單因素試驗(yàn) 以 HSYA轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo),分別考察了終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、攪拌速度、藥液初始質(zhì)量濃度、醇沉溫度和藥液 pH等因素對(duì)醇沉效果的影響,為正交試驗(yàn)因素水平的選擇提供依據(jù)。

2.5.1 終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì) HSYA轉(zhuǎn)移率的影響 醇沉條件：藥液初始質(zhì)量濃度 1.10 g/ml,攪拌速度 300 r/min,醇沉溫度為室溫,不調(diào)節(jié)藥液 pH(此時(shí) pH為 4.78),醇沉終點(diǎn)時(shí)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 50%、60%、70%、80%、85%,結(jié)果見圖 1(A)。結(jié)果表明,終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)在 50%～60%內(nèi),HSYA轉(zhuǎn)移率增加,60%時(shí)達(dá)到最大值,之后隨著乙醇的加入,析出的雜質(zhì)顆粒粒徑增大,包裹藥液而造成有效成分含量損失,HSYA轉(zhuǎn)移率顯著降低,故終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)宜選擇 60%。

2.5.2 攪拌速度對(duì) HSYA轉(zhuǎn)移率的影響 醇沉條件：藥液初始質(zhì)量濃度為 1.10 g/ml,醇沉溫度為室溫,不調(diào)節(jié)藥液 pH,終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) 60%,攪拌速度分別為 100 r/min、300 r/min、500 r/min、700 r/min和 900 r/min。圖 1(B)顯示,隨著攪拌速度的增大,HSYA轉(zhuǎn)移率先增大后減小。因?yàn)閿嚢杷俣冗^小,乙醇分布不均勻,導(dǎo)致高質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇部分有效成分損失增加;而攪拌速度過大,析出的雜質(zhì)顆粒受到撞擊力過大而黏附在燒杯壁上,黏附的雜質(zhì)易包裹藥液造成有效成分損失,故攪拌速度宜選擇500 r/min。

2.5.3 藥液初始質(zhì)量濃度對(duì) HSYA轉(zhuǎn)移率的影響 醇沉條件：醇沉溫度為室溫,攪拌速度500 r/min,不調(diào)節(jié)藥液 pH,終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%,藥液初始質(zhì)量濃度分別為 1.00 g/ml、1.05 g/ml、1.10 g/ml、1.15 g/ml。由圖 1(C)可知,在試驗(yàn)條件下,HSYA轉(zhuǎn)移率隨藥液初始質(zhì)量濃度的增大而增大,但轉(zhuǎn)移率增速逐漸變慢,當(dāng)藥液初始質(zhì)量濃度高于 1.10 g/ml時(shí),轉(zhuǎn)移率增速不明顯,故本實(shí)驗(yàn)藥液初始質(zhì)量濃度宜選擇 1.10 g/ml。

2.5.4 醇沉溫度對(duì) HSYA轉(zhuǎn)移率的影響 醇沉條件：藥液初始質(zhì)量濃度 1.15 g/ml,攪拌速度 500 r/min,不調(diào)節(jié)藥液 pH,終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) 60%,低溫恒溫槽調(diào)節(jié)溫度分別為 5℃、10℃、15℃、20℃和 25℃。圖 1(D)顯示,醇沉溫度對(duì) HSYA轉(zhuǎn)移率影響不大,考慮到降低能耗和簡化操作,選擇室溫為適宜的醇沉溫度。

2.5.5 藥液 pH對(duì) HSYA轉(zhuǎn)移率的影響 醇沉條件：藥液初始質(zhì)量濃度 1.15 g/ml,醇沉溫度為室溫,攪拌速度 500 r/min,不調(diào)節(jié)藥液pH,終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) 60%,調(diào)節(jié) pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和 9.0。圖 1(E)表明 ,隨著藥液 pH的增大,HSYA轉(zhuǎn)移率逐漸降低,故藥液 pH宜選擇 4.0。

2.5.6 單因素影響程度的比較 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、藥液初始質(zhì)量濃度和藥液 pH這 3個(gè)因素對(duì) HSYA轉(zhuǎn)移率的影響比較明顯;然后是攪拌速度,而醇沉溫度對(duì)HSYA轉(zhuǎn)移率影響小。計(jì)算各因素對(duì) HSYA轉(zhuǎn)移率影響的極差,按從大到小依次為：終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) ＞藥液初始質(zhì)量濃度 ＞藥液 pH＞攪拌速度 ＞醇沉溫度。

2.6 正交試驗(yàn)

2.6.1 因素水平的選擇 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選擇終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) (A)、藥液初始質(zhì)量濃度 (B)、藥液 pH(C)以及攪拌速度(D)4個(gè)影響相對(duì)較大的因素,按四因素、三水平進(jìn)行 L9(34)正交設(shè)計(jì)法 (表 1)。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levelsof orthogonal test

2.6.2 多指標(biāo)綜合評(píng)分[7]中藥醇沉工藝,應(yīng)在保證主要有效成分保留率的前提下,盡可能多的提高純度以及其它藥用成分的含量。因此,本實(shí)驗(yàn)以 HSYA轉(zhuǎn)移率、浸出物得率和純度為指標(biāo),利用綜合加權(quán)評(píng)分法確定最佳醇沉條件。評(píng)分時(shí)以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化,再給出不同的權(quán)重。具體權(quán)重為：HSYA被認(rèn)為是紅花的主要有效成分,故設(shè)HSYA轉(zhuǎn)移率權(quán)重系數(shù)為 0.5,浸出物的量用以代表紅花醇沉液中所有組分的量,包括 HSYA和其他有效成分,故將浸出物得率的權(quán)重系數(shù)設(shè)為 0.3,將純度的權(quán)重系數(shù)設(shè)為 0.2。

2.6.3 最佳醇沉條件的選擇 由表 2知,在所選的因素水平范圍內(nèi),各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響程度從大到小依次為：A＞B＞D＞C,最優(yōu)的工藝組合為：A1B3C3D3。方差分析結(jié)果表明,終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) (A)和藥液初始質(zhì)量濃度(B)對(duì)綜合評(píng)分有顯著性影響 (P＜0.05),因此這 2個(gè)因素的最優(yōu)水平分別為 A1和 B3。由于藥液初始 pH為 4.78(接近 5.00),而該因素對(duì)綜合評(píng)分的影響沒有顯著性,因此最優(yōu)水平為 C2,即 5.00,為簡化操作,也可選擇不調(diào)節(jié)藥液 pH。由于攪拌速度對(duì)綜合評(píng)分的影響也沒有顯著性差異,從節(jié)能角度考慮,攪拌速度越小越好,但為了保證藥液和混合均勻,避免局部乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高引起有效成分包裹損失,選擇攪拌速度 500 r/min,與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。綜合得出,紅花提取液最佳的醇沉工藝為終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) 50%,藥液初始質(zhì)量濃度 1.15 g/ml,攪拌速度 500 r/min,藥液 pH 5.00。為進(jìn)一步考察優(yōu)選工藝的可靠性,保證工藝穩(wěn)定可行,按上述最佳提取工藝進(jìn)行 3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得 HSYA平均轉(zhuǎn)移率為 94.5%,RSD 0.95%;上清液中浸出物平均得率為 23.3%,RSD 1.98%;上清液固形物中HSYA平均純度為 66.9%,RSD 1.69%。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明,優(yōu)選工藝穩(wěn)定可靠。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析Table 2 Analysisof the results of the orthogonal test

表3 方差分析表Table 3 Analysisof variance

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的紅花提取液最佳醇沉工藝為：終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù) 50%,藥液初始質(zhì)量濃度 1.15 g/ml,攪拌速度 500 r/min,藥液 pH 5.00。在此工藝條件下,不僅有效成分轉(zhuǎn)移率和浸出物得率較高,而且純度 (66.9%)也較傳統(tǒng)的大孔樹脂純化工藝 (30.5%)大大提高。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明,優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可靠。

研究表明[8]攪拌速度對(duì)醇沉過程顆粒形態(tài)結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)過程均有較大影響,而沉淀的形態(tài)結(jié)構(gòu)與有效成分的保留關(guān)系密切,故將攪拌速度作為單因素試驗(yàn)考察因素之一。初始質(zhì)量濃度過高的藥液黏稠度高,難以與乙醇充分接觸,析出的沉淀易包裹藥液而造成有效成分損失;初始質(zhì)量濃度過低則藥液量大,耗費(fèi)乙醇,延長時(shí)間。因此要將藥液濃縮到一定質(zhì)量濃度后再進(jìn)行醇沉。有文獻(xiàn)報(bào)道[9]HSYA受熱反應(yīng)可能有水分子參與,因此醇沉溫度選取了低于常溫(25℃)進(jìn)行考察,防止 HSYA發(fā)生變化。再結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇了終點(diǎn)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和藥液 pH作為單因素試驗(yàn)的其它兩個(gè)考察因素。

應(yīng)用多指標(biāo)綜合評(píng)分法設(shè)置指標(biāo)的權(quán)重,需要根據(jù)具體情況具體分析。一般來說,在指標(biāo)成分明確的前提下,浸出物得率越高則純度越低,但如果有多種有效成分,且部分成分不明確,以浸出物多少來代表總有效成分時(shí),浸膏得率的權(quán)重系數(shù)應(yīng)相應(yīng)增大,并設(shè)為正權(quán)重系數(shù),純度的高低則反映某一主要指標(biāo)成分在總有效成分中所占的比例,設(shè)為正權(quán)重系數(shù)。

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Optimization of alcohol precipitation process for extract of Carthamustinctorius by multiple guidelines grad ing method

YUAN Jia,L IYe-rui,CHEN Yong,WANGLong-hu,L IU Xue-song
(College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

Objective：To investigate the optimal alcohol precipitation parameters for extract of Carthamus tinctorius.Methods：The effects of different factors on the transfer rate of hydroxy safflower yellow A(HSYA)was studied via single factor experiments,including the final alcohol concentration of the liquor,the speed of stirring,the initial density of the extract,the temperature and the pH of the liquor.Based on the results of single factor experiments,the final alcohol concentration of the liquor,the speed of stirring,the initial density of the extract and the pH of the liquor were studied by an orthogonal test and a multiple guidelines grading method,and the transfer rate of HSYA,the yield and the purity of extract in the supernatantwere used as comprehensive evaluation index.Results：The op timal alcohol precipitation processof Carthamus tinctorius extractwas as follows：the final alcohol concentration of the liquor 50%,the speed of stirring 500 r/min,the initial density of the extract 1.15 g/ml and the pH of the liquor 5.0.Conclusion：The proposed alcohol precipitation process isconvenient and steady with high transfer rate of HSYA,high yield and purity of extract in the supernatant.

Carthamus tinctorius/isol;Precipitation;ORTHOGONAL test;PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY(TCD)/methods

R 284.2

A

1008-9292(2011)01-0027-06

http：∥www.journals.zju.edu.cn/med DO I：10.3785/j.issn.1008-9292.2011.01.006

2010-09-15

2010-11-16

浙江省自然科學(xué)基金 (Y2080704);國家自然科學(xué)基金.

袁 佳 (1987-),女,碩士生.

劉雪松 (1973-),男,博士,副教授,主要從事中藥醇沉工藝的研究;E-mail：liuxuesong@zju.edu.cn

[責(zé)任編輯 黃曉花 ]