還原糖電化學檢測方法和裝置研究*

(1.山東省科學院生物研究所，濟南 250014； 2. 山東大學生命科學學院，濟南 250010；3.山東省生物傳感器重點實驗室，濟南 250014； 4.山東魯洲生物科技有限公司，沂水 276400)

目前食品中還原糖的分析方法較多，現(xiàn)行國家專業(yè)標準[1]及國際官方分析化學家協(xié)會(AOAC)推薦方法[2]中，均采用容量分析法，即斐林試劑滴定法和高錳酸鉀滴定法。這兩種方法對滴定終點的判斷帶有經驗性，干擾因素多[3]，受操作者主觀因素影響較大，對還原糖的評價不夠準確。除經典的滴定分析方法外，儀器分析方法有液相色譜法[4]、電化學法[5-8]、間接原子吸收法[9]和分光光度法[10,11]等。斐林試劑光度法[12]由于斐林試液與還原糖作用后產生氧化亞銅沉淀，測定溶液吸光度時需進行離心分離，比較繁瑣；鐵氰化鉀光度法[13]則要求在沸水浴條件下反應，且時間較長。許漢英等[14]建立了蜂蜜中還原糖的流動注射-分光光度分析方法。筆者利用還原糖與鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]反應后生成的亞鐵氰化鉀[K4Fe(CN)6]能夠進行電化學測定的原理，將流動注射技術與電化學安培方法相結合，研究還原糖的流動電化學檢測裝置和方法，旨在為食品中還原糖測定及產品質量檢驗提供快速、簡便、準確的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

電化學分析儀：CHI614c型，上海辰華儀器公司；

恒溫水浴鍋：HH-S型，江蘇國勝實驗儀器廠；

電化學三電極檢測系統(tǒng)：自制Ag/AgCl參比電極(1 mol/L KCl)，直徑2 mm金圓盤工作電極(天津艾達恒晟科技發(fā)展有限公司)，自制不銹鋼管輔助電極；

葡萄糖、鐵氰化鉀、氫氧化鈉：均為分析純；

蜂蜜：市售；

實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 溶液的配制

標準葡萄糖儲備液：200.0 g/L，精確稱取20.00 g烘干葡萄糖，加蒸餾水溶解，定容至100 mL，備用。

系列葡萄糖標準溶液：分別準確移取75.0、50.0、25.0、12.5 mL 200.0 g/L標準葡萄糖儲備液，用蒸餾水定容至100 mL，配制成濃度分別為150.0、100.0、50.0、25.0 g/L的系列葡萄糖標準溶液。

0.5% K3Fe(CN)6-1.2%NaOH混合溶液：準確稱取2.500 g K3Fe(CN)6和6.000 g NaOH，用蒸餾水溶解后，定容至500 mL，備用。此混合溶液可在室溫下放置1個月。

蜂蜜待測液：稱取混合均勻的蜂蜜樣品約6 g(精確到0.001 g)，用蒸餾水溶解，然后移入50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容。

橙汁：某品牌橙汁飲料原液作為待測液。

發(fā)酵液：將2份發(fā)酵液離心后取上清液作為待測液。

糖化液：將5份糖化液離心后取上清液，分別稀釋3、5、5、5、7倍，配制成待測液。

1.3 試驗方法

(1)裝置和原理

實驗裝置示意圖見圖1。在儲液瓶中裝有0.5% K3Fe(CN)6-1.2% NaOH的底液，通過蠕動泵進樣到預混池，預混池上端有一直徑2 mm的小孔。當測樣時用微量注射器取10 μL葡萄糖標準溶液或含有還原糖的待測溶液，通過預混池上端小孔注入。電磁攪拌池中溶液使待測液與底液充分混合后，通過蠕動泵將混合液泵入水浴加熱的盤管反應器中，還原糖在堿性溶液中能將K3Fe(CN)6還原為K4Fe(CN)6；反應溶液進一步流經在室溫水浴中的盤管使溶液冷卻。最后包含K4Fe(CN)6、NaOH、過量的K3Fe(CN)6等物質的溶液進入測定池。在反應中由于K3Fe(CN)6是過量的，還原糖含量與生成的K4Fe(CN)6的濃度呈一定摩爾關系，而K4Fe(CN)6是一種電化學氧化還原活性物質，在一定正電位下能夠被氧化生成K3Fe(CN)6。測定池為自行設計的適合流動檢測的電化學檢測池，兩邊分別固定Ag/AgCl參比電極和金圓盤工作電極，其中一段用作溶液流通管道的不銹鋼管作為輔助電極，通過CHI614c電化學工作站在工作電極上施加恒定電位，記錄由K4Fe(CN)6氧化產生的氧化電流，由計算機輸出圖形。由于K4Fe(CN)6的氧化電流與還原糖濃度呈一定的相關性，因此可以根據(jù)測得的K4Fe(CN)6氧化電流信號計算還原糖的含量。

1—儲液瓶； 2—蠕動泵； 3—預混池； 4—熱水?。?5—冷水??； 6—參比電極； 7—工作電極； 8—輔助電極； 9—測定池； 10—廢液； 11—數(shù)據(jù)輸出圖1 實驗裝置示意圖

(2)參比電極的制作

將一根直徑500 μm、長約5 cm的Ag絲用金相砂紙打磨掉表面的氧化層，直至明亮光滑，以保證鍍在Ag絲上的AgCl層均勻牢固，從而達到其電位穩(wěn)定。將打磨好的Ag絲在丙酮中超聲清洗約30 min，除去Ag絲表面油污、雜質等，再在二次水中超聲清洗3次，每次5 min。以清洗干凈的Ag絲作為正極，另一根直徑為500 μm Ag絲作為負極，兩電極間加+1.5 V直流電壓，在1.00×10-3mol/L KCl溶液中進行電鍍。在作為正極的Ag絲表面會有AgCl生成，約12 h后，取出鍍好的Ag/AgCl絲。在未鍍有AgCl的Ag絲一端焊上一根粗銅絲，起導電作用，并且避免實驗過程中Ag絲被折斷。把Ag/AgCl絲插入一根加工好的前端封有素燒陶瓷的聚四氟乙烯管中，使銅絲與Ag絲接界處的焊錫剛好處于管口外，向管中注入1 mol/L KCl溶液，然后用環(huán)氧樹脂膠封閉管口，室溫固化24 h。最后將做好的Ag/AgCl參比電極插入一個盛滿1 mol/L KCl溶液的塑料瓶中，保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結果與討論

2.1 測定電位的選擇

取50.0 g/L葡萄糖標準溶液10 μL注入預混池中，使用電化學分析儀的循環(huán)伏安技術記錄工作電極在0～0.45 V間的循環(huán)伏安曲線，如圖2所示。由于K3Fe(CN)6和K4Fe(CN)6是一對可逆的氧化還原物質，所以此圖為溶液中過量的K3Fe(CN)6與反應生成的K4Fe(CN)6共同在金圓盤工作電極上反應產生的循環(huán)伏安圖。從圖2中可看出K4Fe(CN)6從0.1 V開始被氧化為K3Fe(CN)6，電位為0.26 V時氧化電流達到峰值。當用安培法測定K4Fe(CN)6的氧化電流時，工作電極的檢測電位必須設定為比0.26 V更高的電位，本實驗選擇電位為0.40 V。

圖2 工作電極在K4Fe(CN)6溶液中的循環(huán)伏安曲線

2.2 進液管道直徑與測定池直徑比例的選擇

由于工作電極產生的檢測電流在微安級，所以當進液管道的直徑與測定池的直徑之比為1∶4時，進液泵蠕動產生的脈動波將對檢測電流產生脈動波形干擾，如圖3中曲線1所示；而當二者之比為1∶4.5時進液泵產生的脈動波形干擾減輕，見圖3中曲線2；當二者比值為1∶5時，脈動干擾進一步減輕，見圖3中曲線3。在本實驗裝置實際使用過程中控制進液管道直徑與測定池直徑之比為1∶6可以完全消除蠕動泵產生的脈動波干擾，見圖3中曲線4。

曲線1～4進液管道的直徑與測定池的直徑之比依次為1∶4、1∶4.5、1∶5、1∶6圖3 脈動波對測定電流的影響

2.3 測定液流動狀態(tài)的選擇

在多數(shù)電化學測定過程中，需要保證溶液本體濃度不隨反應的進行而改變。在本實驗中，若使溶液在靜止狀態(tài)下進行電化學測定，由于研究電極面積與溶液體積之比較大，隨著反應的進行，電極附近溶液中K4Fe(CN)6的本體濃度逐漸降低，從而使得反應電極上的測定電流在電極去極化穩(wěn)定后很快就出現(xiàn)衰減現(xiàn)象，導致數(shù)據(jù)讀取困難、采樣終點波動、分析誤差增大。為了保證電極表面K4Fe(CN)6的濃度保持穩(wěn)定，將待測液在電磁攪拌下測定，結果發(fā)現(xiàn)攪拌引起的噪音很大，完全掩蓋了測定電流信號。當溶液在流動狀態(tài)下進行測定時，發(fā)現(xiàn)測定電流曲線在30～60 s內平直穩(wěn)定無衰減，且3次測定的電流曲線基本重合。所以本實驗中選擇溶液在流動狀態(tài)下進行電化學測定。

2.4 反應液中氣泡對測定的影響及其消除

還原糖與鐵氰化鉀的反應需在60～100℃進行[12]，實驗發(fā)現(xiàn)當加熱時反應液中會產生氣泡，反應溫度越高，測定液中氣泡越多，夾雜著氣泡的溶液流經測定池中的電極表面，對測定電流干擾也越大。當反應溫度為100℃時，大量氣泡的產生對測定電流產生很大干擾；當溫度為95℃時，由氣泡產生的噪音干擾仍較大。隨著溫度的降低，干擾越來越小。當溫度為90℃時，由氣泡產生的噪音干擾明顯減少；當溫度降為85℃時，管道中只有極少的氣泡引起電流波動。經觀察進液管道中的氣泡進入測定池后都是貼著池壁上行，上行中的氣泡一旦經過電極表面即對測定電流產生干擾，而要使氣泡上行時不接觸電極表面，必須使進液管道直徑小于測定池直徑的5倍以上。本實驗選擇反應溫度為85℃，使用自行設計的合適尺寸的測定池，即可消除氣泡對測定的干擾，得到平滑穩(wěn)定的電流曲線。

2.5 標準工作曲線及檢出限

在預混池中泵入包含0.5% K3Fe(CN)6和1.2% NaOH的混合液后，用微量注射器分別取0、25.0、50.0、100.0、150.0 g/L葡萄糖標準溶液10 μL注入預混池中進行測定。每更換一次葡萄糖溶液，第1次進入測定池的溶液用作清洗管道和測定池，不進行電化學檢測，從第2次進入的溶液開始電化學安培法檢測。測定池中的溶液在流動狀態(tài)下恒定工作電極電位0.40 V(vs.Ag/AgCl)，記錄K4Fe(CN)6被氧化的電流-時間(i-t)曲線。取30 s時的穩(wěn)定電流i，繪制電流-葡萄糖濃度(i-c)標準工作曲線，線性回歸方程為i=1.821+0.058 1c。i為K4Fe(CN)6的穩(wěn)定氧化電流(A)，c為標準葡萄糖濃度(g/L)，相關系數(shù)r=0.999 9?？梢姶梭w系還原糖濃度在0～150.0 g/L范圍內，與K4Fe(CN)6的氧化電流之間有良好的線性關系。

移取50.0 g/L葡萄糖標準溶液10 μL注入預混池中，連續(xù)測定8次，由K4Fe(CN)6氧化電流(見表1)的標準偏差的3倍與工作曲線斜率之比，得檢出限為1.19 g/L。

2.6 精密度試驗

分別準確移取50.0 g/L葡萄糖標準溶液和橙汁待測液10 μL注入預混池，重復測定8次，由所測的K4Fe(CN)6氧化電流計算出對應的葡萄糖濃度和樣品中的還原糖含量，結果見表1。

表1 精密度試驗結果(n=8)

由表1可見，葡萄糖標準溶液和樣品溶液測定結果的相對標準偏差分別為0.74%、1.72%，證明此方法的精密度良好。

2.7 樣品的測定及加標回收試驗

取10 μL樣品待測液注入預混池中，以下同標準工作曲線的繪制。每份樣品平行測定3次，將i-t曲線上30 s時的穩(wěn)定電流i取平均值，數(shù)值代入標準工作曲線，從而計算出待測樣液中還原糖的含量(以葡萄糖計)。

在被測樣品中加入已知含量的葡萄糖溶液，進行不同樣品的回收試驗，結果見表2。

表2 回收試驗結果(n=3)

表2結果表明，該檢測方法測定不同類型樣品的回收率為97.8%～101.2%，說明該方法抗干擾性能良好，測定結果準確可靠，能滿足測定不同類型樣品的需要。

2.8 對照試驗

對配制的糖化液和發(fā)酵液待測液進行電化學測定，同時用常規(guī)斐林滴定法進行對比，結果見表3。

表3 對照試驗(n=3)

對兩組結果進行t檢驗，P>0.05，表明兩種分析方法無顯著差異。

3 結論

將流動注射技術與電化學檢測相結合，設計了適合流動注射測定的電化學檢測池，并使溶液混合、反應、檢測集中于一條管道中，實現(xiàn)了橙汁、蜂蜜、糖化液、發(fā)酵液多種樣品中還原糖的半自動電化學檢測。該法具有準確度高、精密度好、操作簡單等特點，可以滿足多種樣品中還原糖測定的需要。

方法的線性范圍寬，還原糖濃度在0～150.0 g/L范圍內有良好的線性關系；對于還原糖含量高的樣品，可以減小待測樣的稀釋倍數(shù)，降低了因稀釋倍數(shù)太大導致的誤差。提高了還原糖的分析速度，電極實際響應時間約30 s，加上前處理樣品的測定時間不超過4 min，尤其適用于大量樣品的分析。與光度法相比，電化學技術不受溶液顏色、濁度的影響，抗干擾力較強。

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