GC-MS法測定發(fā)酵食品中氨基甲酸乙酯含量的測量不確定度評定*

譚波濤 郝媛媛

(安徽省阜陽市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，阜陽 236000)

氨基甲酸乙酯又名聚氨酯(ethyl carbamate，簡稱EC)存在于發(fā)酵食品中，是一種多位點致癌物[1]。針對發(fā)酵食品中EC的測定，目前主要以儀器分析為主，如高效液相色譜-熒光檢測器法(HPLC-FLD)[2]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[3-5]等。筆者以氨基甲酸丁酯作為內(nèi)標(biāo)物，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、選擇離子檢測模式用于發(fā)酵食品中EC的測定，并對EC測量結(jié)果的不確定度進(jìn)行了評估。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：5975C型，配多功能自動進(jìn)樣器，美國Agilent公司；

固相萃取裝置：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-2000型，上海申勝生物技術(shù)有限公司；

超聲波儀：SK1200H型，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；

去離子水發(fā)生器：AXLB1020-1型，重慶阿修羅科技發(fā)展有限公司；

甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯：色譜純；

無水硫酸鈉：經(jīng)650℃灼燒4 h，置于干燥器內(nèi)備用；

標(biāo)準(zhǔn)品EC、氨基甲酸丁酯：純度均為99.0%，上海安譜科技有限公司；

實驗室用水均為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Rtx?-Wax(30 m×0.25 mm，0.5 μm，美國瑞斯泰克公司)或相當(dāng)者；進(jìn)樣口溫度：220℃；柱溫程序：初溫40℃，保持1.0 min,以10℃/min升至60℃，再以5℃/min升至160℃，保持1.0 min，最后在220℃下運行10 min；載氣：高純氦氣(99.999%)，流速：1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積：1 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

離子源(EI)溫度：230℃；電子轟擊能量：70 eV；接口溫度:220℃；電子倍增器電壓:1 157 V；選擇離子監(jiān)測方式(SIM)；EC定量離子：m/z62；特征離子：m/z62、74、89；內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯定量離子：m/z62；特征離子：m/z62、74、56；溶劑延遲時間：19.0 min。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g固體樣品或準(zhǔn)確吸取5.0 mL液體樣品于25 mL比色管中，加入氨基甲酸丁酯內(nèi)標(biāo),飽和氯化鈉溶液溶解并定容至刻度，振蕩提取30.0 min，過濾。準(zhǔn)確移取上述待測樣液5.0 mL加到5.0 g的硅藻土液液萃取小柱上，靜置吸附5 min，用30 mL二氯甲烷均分6次洗脫硅藻土萃取柱，將洗脫液用無水硫酸鈉過濾后于30℃下旋干，用乙酸乙酯定容至5.0 mL，混勻，待測。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取氨基甲酸丁酯0.104 2 g于100 mL棕色容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容至刻度，配制成濃度為1.042 mg/mL的氨基甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確稱取EC 0.105 7 g于100 mL棕色容量瓶中，乙酸乙酯溶解并定容至刻度，配制成濃度為1.057 mg/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確吸取EC、氨基甲酸丁酯的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，乙酸乙酯溶解逐級稀釋，配制成EC與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0且內(nèi)標(biāo)物濃度為400 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)校正溶液系列濃度供GC-MS測定。

1.6 定性定量

吸取1 μL試樣液或標(biāo)準(zhǔn)液注入氣質(zhì)聯(lián)用儀中，以EC與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值為橫坐標(biāo)，EC與內(nèi)標(biāo)物的峰高比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以試樣峰與內(nèi)標(biāo)峰的相對保留時間定性，以試樣峰與內(nèi)標(biāo)峰的定量離子峰高比多點校正后定量。

2 數(shù)學(xué)模型

樣品中EC含量測量結(jié)果可以表示為：

式中：X——試樣中EC含量，ng/g；

Asn——實際樣品中EC的峰高；

As1——實際測定時，內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的峰高；

ms1——實際測定時，內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的質(zhì)量，ng；

m——樣品質(zhì)量，g；

fv——實際測定時樣品和內(nèi)標(biāo)物稀釋倍數(shù)；

R——EC及其內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的相對校正因子，

An——EC標(biāo)樣的峰高；

c1——內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的濃度，ng/mL；

A1——內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的峰高；

cn——EC的濃度，ng/mL。

3 測定結(jié)果

5個標(biāo)準(zhǔn)溶液分別測量3次，結(jié)果見表1、表2。

表1 EC-氨基甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)校正液峰高系列測定結(jié)果

表2 EC-氨基甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)校正液中標(biāo)準(zhǔn)品峰高(Ani)與內(nèi)標(biāo)峰高(A1i)之比的測定結(jié)果

根據(jù)表1和表2數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性方程為y=1.310 225x-0.002 434，其中曲線相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，b=1.310 225，a=-0.002 434。當(dāng)內(nèi)標(biāo)濃度為400 ng/mL時，重復(fù)性條件下測定樣品6次，對應(yīng)的樣品濃度比和樣品測定結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果

4 發(fā)酵食品中EC測量結(jié)果的不確定度評定

從實驗方法和數(shù)學(xué)模型可以看出，檢驗由標(biāo)準(zhǔn)液制備、樣品制備、儀器測定等幾部分組成。因此測量不確定度的主要來源有(1)EC及其內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯相對校正引入的不確定度；(2)內(nèi)標(biāo)物純度及樣品和內(nèi)標(biāo)物稱量引入的不確定度；(3)定容配制測量液、進(jìn)樣引入的測量不確定度;(4)實際測量過程中，樣品中EC的峰高和內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的峰高比(Asn/Asl)引入的不確定度；(5)重復(fù)性測量引入的不確定度。

4.1 EC及其內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯校正引入的不確定度

(1)擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求值引入的不確定度

以EC與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值X為橫坐標(biāo)，EC與內(nèi)標(biāo)物的峰高比值Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，曲線的斜率即為相對校正因子R。根據(jù)表1和表2數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中殘余標(biāo)準(zhǔn)差S和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中自變量偏差平方和Sxx分別為：

測量樣品溶液6次，即P=6，根據(jù)表3數(shù)據(jù)，樣品溶液由于擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求值引入的不確定度為：

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

(2)EC-氨基甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)校正液濃度比引入的測量不確定度

配制EC-氨基甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)校正液時，EC標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品稱量、定容等過程將引入不確定度。但是使用線性最小二乘法擬合曲線、求取相對校正因子的前提是假定橫坐標(biāo)量的不確定度遠(yuǎn)小于縱坐標(biāo)量的不確定度[6,7]。通常的An/Al不確定度計算程序僅僅與EC和內(nèi)標(biāo)物的峰高比值有關(guān)，而與EC-氨基甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)校正液不確定度無關(guān)，也不與從同一溶液中逐次稀釋產(chǎn)生必然的相關(guān)性，因此EC-氨基甲酸丁酯標(biāo)準(zhǔn)校正液濃度比引入的測量不確定度可以忽略不計。

4.2 內(nèi)標(biāo)物純度及樣品和內(nèi)標(biāo)物稱量引入的不確定度

(1)根據(jù)氨基甲酸丁酯的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，標(biāo)樣的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.0%,按照正態(tài)分布估算，取包含因子為3。則內(nèi)標(biāo)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度un1,rel約為0.0034。

4.3 實際測量時，內(nèi)標(biāo)物稱量、定容配制測量液引入的測量不確定度

(1) 使用容量瓶、移液管或移液槍所引入的體積不確定度主要有3個分量:①體積校準(zhǔn)引入的不確定度分量uV1，按JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》和JJG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》規(guī)定的容量允差計算；②充滿液體至刻度的變動性引入的不確定度分量uV2，通過A 類不確定度評定得到，具體做法為連續(xù)核查10 次排出的體積的標(biāo)準(zhǔn)偏差(通過稱量決定)；③溶液溫度與檢定標(biāo)準(zhǔn)溫度(20℃) 不同引入的不確定度分量uV3，根據(jù)溶液體積膨脹系數(shù)計算。

(3)在估算溫度變化對體積不確定度影響時，認(rèn)為實驗室的溫度一般在±4℃之間變動。液體體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，因此只需考慮前者。乙酸乙酯的體積膨脹率按照20℃時系數(shù)1.39×10-3/℃計算。根據(jù)實驗情況，各體積不確定度見表4。

表4 容量瓶、移液管或移液槍引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4.4 樣品測量中EC的峰高和內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的峰高比(Asn/Asl)引入的不確定度

4.5 重復(fù)性測量引入的不確定度

重復(fù)性測量引入的不確定度采用A類評定。表3數(shù)據(jù)在格拉布斯檢驗0.95置信水平下無粗大異常值。根據(jù)貝塞爾公式，計算6次測量標(biāo)準(zhǔn)差的相對值為：

5 相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對擴(kuò)展不確定度

根據(jù)以上評估過程，將不確定度的A類評定結(jié)果和各分量評估結(jié)果合成，得出相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

X=21.51 ng/mL,Urel=8.7%,k=2。

6 結(jié)語

通過對發(fā)酵食品中EC含量測量過程中影響測量結(jié)果不確定度的各因素進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在測量結(jié)果的合成不確定度中，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求值引入的不確定度分量貢獻(xiàn)最大，其次是由樣品測量中EC的峰高和內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丁酯的峰高比(Asn/Asl)引入的不確定度分量。其原因是由于檢測器的計量特性、樣品分離條件和檢測重復(fù)性引入了較大的不確定度。由于測定采用了內(nèi)標(biāo)法，進(jìn)樣量變化和實驗條件變化引入的誤差將因為測定的峰高比(Asn/Asl)而相互抵消。合理選擇樣品分離條件、提高儀器精度、提高操作人員技能、保證人員規(guī)范操作、合理選擇內(nèi)標(biāo)物的濃度、使其峰高與待測組分峰高不要相差太大，都可以有效減少不確定度，保證測量結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。

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