膽道閉鎖患兒外周血T細(xì)胞ITGAL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)及其mRNA表達(dá)

董 瑞 趙 瑞 鄭 珊 宋 再 孫 松

膽道閉鎖(BA)病因未明，一般認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制涉及母親孕期病毒感染、自身免疫介導(dǎo)的膽管破壞及膽道發(fā)育異常[1]。隨著對(duì)自身免疫性疾病的深入研究，發(fā)現(xiàn)其與DNA甲基化有著密切的關(guān)系，DNA甲基化在維持T細(xì)胞功能方面發(fā)揮著重要作用，DNA甲基化異常可導(dǎo)致T細(xì)胞體外自身反應(yīng)和體內(nèi)自身免疫反應(yīng)[2]。

目前，在自身免疫性疾病中研究較多的是ITGAL基因，其主要編碼人功能相關(guān)抗原-1 (LFA-1)，是甲基化敏感基因。ITGAL基因DNA低甲基化可導(dǎo)致LFA-1表達(dá)升高，且與T細(xì)胞自身免疫性密切相關(guān)[2]。在BA局部病變組織(肝臟組織和膽管區(qū))中可發(fā)現(xiàn)LFA-1表達(dá)升高[3～5]，但其在BA患兒外周血中的作用未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于ITGAL基因的異常表達(dá)與自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，本研究分析BA患兒CD4+和CD8+T細(xì)胞ITGAL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，探討其與mRNA表達(dá)的關(guān)系，以期對(duì)BA的發(fā)病機(jī)制有所提示。

1 方法

1.1 BA病例納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 同時(shí)滿足以下條件的患兒進(jìn)入本文分析：①?gòu)?fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)初診(在外院未予外科干預(yù))，均經(jīng)我院外科手術(shù)后病理學(xué)檢查診斷為BA的患兒；②日齡<90 d；③除臍疝外，無(wú)明顯肝外合并畸形；④排除血標(biāo)本溶血或操作中淋巴細(xì)胞損失嚴(yán)重的病例。

1.2 分組設(shè)計(jì) 進(jìn)入本文分析的BA患兒分為2組：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的樣本量要求[6]，本研究預(yù)先設(shè)定選取5例BA患兒為甲基化結(jié)果驗(yàn)證組；余BA患兒為BA組，細(xì)胞分離提取DNA和RNA后行ITGAL甲基化水平和mRNA表達(dá)分析。另選取我院同期行斜疝手術(shù)、日齡≤120 d和肝功能、腎功能正常的患兒為對(duì)照組，樣本量與BA組1∶1匹配。

1.3 倫理 本研究方案經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，均獲得進(jìn)入研究患兒父母的口頭知情同意。

1.4ITGAL基因甲基化水平和mRNA表達(dá)分析

1.4.1 細(xì)胞分離 納入患兒均采集靜脈血3 mL，淋巴細(xì)胞分離液(型號(hào)LTS1077，天津TBD公司)常規(guī)分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)。采用CD4+和CD8+分選磁珠，型號(hào)分別為130-045-101和130-045-201(德國(guó)Miltenyi Biotec公司)，按說(shuō)明書(shū)操作分離BA組和對(duì)照組的CD4+和CD8+T細(xì)胞。

1.4.2 DNA和RNA提取 以DNA、RNA共提取試劑盒(北京Tiangen有限公司)提取分離細(xì)胞的DNA和RNA。

1.4.3 甲基化水平檢測(cè) 取DNA約1 μg，按甲基化試劑盒 EZ DNA Methylation-Gold Kit(北京天漠科技開(kāi)發(fā)有限公司)操作處理。處理過(guò)的DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增ITGAL基因啟動(dòng)子調(diào)控序列近端-250～250 bp目的片段、遠(yuǎn)端-1450～-950 bp目的片段，引物序列見(jiàn)表1。將膠回收試劑盒(美國(guó)Axygen公司)凝膠回收的PCR產(chǎn)物與pMD19-T(日本Takara公司)室溫連接2 h以上。取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布含Amp抗性的LB平板皿，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。每個(gè)平板挑10個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。將菌落PCR呈陽(yáng)性的5個(gè)克隆接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；用質(zhì)粒小量提取試劑盒(美國(guó)Axygen公司)提取質(zhì)粒，并送測(cè)序。測(cè)序由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成。采用CG二核苷酸甲基化狀態(tài)評(píng)估甲基化水平。

1.4.4ITGAL基因mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)RT-PCR法檢測(cè)。采用日本TAKARA公司逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒。ITGAL基因及β-actin 引物序列由上海生工技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)完成。ITGAL基因(CD11a)上游引物：5′-CACATCTTTCACACTTCCACCA-3′，下游引物：5′-AGCCTT-TACCCTCACAGTTCACT-3′；β-actin上游引物：5′-TCCTTCC-TGGGCATGGAGT-3′，下游引物：5′-CAGGAGGAGCAATGAT-CTTGAT-3′。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量法[7]進(jìn)行結(jié)果分析。

表1 巢式PCR引物序列表

1.5 甲基化結(jié)果驗(yàn)證 甲基化結(jié)果驗(yàn)證組患兒分離CD4+和CD8+T細(xì)胞后，加入含10%胎牛血清、1%雙抗的1640培養(yǎng)基及1 μg·mL-1PHA，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出后等分為2份，其中1份加入5-氮雜胞苷(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)1 μmol·L-1和IL-2，繼續(xù)培養(yǎng)72 h；另1份不加5-氮雜胞苷，培養(yǎng)72 h。 按上述方法行甲基化水平和ITGAL基因mRNA表達(dá)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 2010年4～8月于我院初診并經(jīng)手術(shù)探查病理證實(shí)為BA患兒25例進(jìn)入分析(圖1)，其中男10例，女15例，日齡43～90 d，平均日齡(58.0±4.5)d。BA組20例，甲基化結(jié)果驗(yàn)證組5例。對(duì)照組20例，其中男8例，女12例，日齡51～120 d，平均日齡(65.0±6.7)d。

圖1 BA病例納入流程圖

Fig 1 Flow chart of selecting biliary atresia infants

2.2 DNA甲基化水平檢測(cè)結(jié)果 BA組和對(duì)照組CD4+、CD8+T細(xì)胞ITGAL基因啟動(dòng)子序列-250～250 bp均未發(fā)生甲基化(圖2)。BA組CD4+T細(xì)胞-1450～-950 bp的CG二核苷酸平均甲基化水平顯著高于CD8+T細(xì)胞，0.94vs0.75，P=0.02(圖2A和B)；也顯著高于對(duì)照組CD4+T細(xì)胞，0.94vs0.66，P<0.001(圖2A和C)。BA組CD8+T細(xì)胞平均甲基化水平與對(duì)照組CD8+T細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，0.75vs0.62，P>0.05(圖2B和D)；對(duì)照組CD4+與CD8+T細(xì)胞的平均甲基化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，0.66vs0.62，P>0.05(圖2C和D)。

5-氮雜胞苷干預(yù)和未予5-氮雜胞苷干預(yù)的CD4+、CD8+T細(xì)胞ITGAL基因啟動(dòng)子序列-250～250 bp均未發(fā)生甲基化(圖3)。5-氮雜胞苷干預(yù)后CD4+(圖3A)和CD8+T細(xì)胞(圖3B)平均甲基化水平均顯著低于未予5-氮雜胞苷干預(yù)的水平，CD4+T細(xì)胞：0.23vs0.45，P<0.001；CD8+T細(xì)胞：0.19vs0.41，P<0.001(圖3C和D)。

圖2 BA組和對(duì)照組CD4+和CD8+T細(xì)胞ITGAL啟動(dòng)子區(qū)平均甲基化水平

Fig 2 The average methylation levels ofITGALgene promoter in CD4+and CD8+T cells in BA and control groups

Notes A: BA CD4+T cells; B: BA CD8+T cells; C: Control CD4+T cells; D: Control CD8+T cells; In BA subjects, the average methylation level ofITGALgene promoter was higher in CD4+than in CD8+T cells. The average methylation level ofITGALgene promoter in CD4+T cells from infants with BA was significantly higher than that in the control. There were no statistical differences in CD8+T cells between BA and control groups, CD4+and CD8+T cells in control group

圖3 5-氮雜胞苷干預(yù)對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞ITGAL啟動(dòng)子區(qū)平均甲基化水平的影響

Fig 3 The average methylation levels ofITGALgene promoter in CD4+and CD8+T cells in 5-azaC treated and untreated groups

Notes A: CD4+T cells (5-azaC untreated); B: CD4+T cells (5-azaC treated); C: CD8+T cells (5-azaC untreated); D: CD8+T cells (5-azaC treated). The average methylation level ofITGALgene promoter was significantly reduced in the treated cells compared with the untreated cells (P<0.05)

2.3ITGAL基因mRNA表達(dá) BA組外周血CD4+T細(xì)胞ITGAL基因mRNA的表達(dá)顯著低于CD8+T細(xì)胞(0.021±0.002vs0.032±0.004，P=0.013)，也顯著低于對(duì)照組CD4+T細(xì)胞(0.021±0.002vs0.031±0.003，P=0.007)。BA組CD8+T細(xì)胞ITGALmRNA表達(dá)與對(duì)照組CD8+T細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.032±0.004vs0.034±0.006，P=0.266)；對(duì)照組CD4+與CD8+T細(xì)胞ITGALmRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.031±0.003vs0.034±0.006，P=0.227)。

5-氮雜胞苷干預(yù)的CD4+和CD8+T細(xì)胞ITGALmRNA的表達(dá)均顯著高于未予5-氮雜胞苷干預(yù)的水平(CD4+T細(xì)胞：0.016±0.002vs0.006±0.002，P=0.013；CD8+T細(xì)胞：0.015±0.002vs0.006±0.001，P=0.025)。

3 討論

BA是新生兒膽汁淤積的常見(jiàn)病因，以肝內(nèi)和肝外膽管進(jìn)行性炎癥及纖維化為主，其病因復(fù)雜。同卵雙胎兒并不同時(shí)發(fā)展為BA，提示非遺傳性因素在BA的形成中起重要作用[8]。DNA甲基化是一種重要的調(diào)控轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳機(jī)制?；蚪MDNA甲基化狀態(tài)改變會(huì)造成染色體不穩(wěn)定或基因表達(dá)異常[9,10]。

人ITGAL基因定位于16p11.2，基因編碼CD11a，編碼LFA-1。LFA-1是β2家族整合蛋白，為α鏈CD11a 和β鏈 CD18 組成的異二聚體，局限在白細(xì)胞上表達(dá)，具有細(xì)胞黏附和共刺激信號(hào)作用，參與免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化、免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)[11,12]。LFA-1缺乏會(huì)導(dǎo)致對(duì)炎癥反應(yīng)能力下降，同時(shí)增加機(jī)體對(duì)感染性疾病的易感性[13,14]。而其高表達(dá)則可降低T細(xì)胞激活所需的抗原閾值，促進(jìn)T細(xì)胞自身反應(yīng)性激活，而且可介導(dǎo)T細(xì)胞黏附，促進(jìn)T細(xì)胞向靶器官聚集[15]。本研究發(fā)現(xiàn)編碼的LFA-1的ITGAL基因mRNA在BA患兒外周血CD4+T細(xì)胞中表達(dá)水平降低。由此，推測(cè)BA患兒中LFA-1的低表達(dá)可使機(jī)體增強(qiáng)對(duì)病毒的易感性，增加了BA發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。既往報(bào)道BA患兒肝臟組織和膽管上皮ITGAL基因表達(dá)升高，提示LFA-1在膽道局部自身免疫反應(yīng)中起重要作用；而造成外周血和肝臟局部表達(dá)不同的原因，則可能是由于BA肝臟及肝外膽道中LFA-1配體(主要是ICAM-1)的高表達(dá)，導(dǎo)致這些細(xì)胞定向的向肝臟局部歸巢，并介導(dǎo)針對(duì)膽道上皮的自身免疫反應(yīng)，故外周血中T細(xì)胞LFA-1表達(dá)下降。

有研究表明LFA-1為甲基化敏感免疫相關(guān)基因，其表達(dá)可能與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)相關(guān)[16]。本研究對(duì)BA組與對(duì)照組的CD4+和CD8+T細(xì)胞的ITGAL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BA組較對(duì)照組CD4+T細(xì)胞的ITGAL基因啟動(dòng)子區(qū)處于相對(duì)高的甲基化狀態(tài)；BA組CD8+T細(xì)胞的ITGAL基因啟動(dòng)子區(qū)也處于類似的高甲基化狀態(tài)，但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有兩方面原因：①可能由于BA 主要是CD4+Th1細(xì)胞所介導(dǎo)的自身反應(yīng)過(guò)程，同時(shí)作為CD4+T細(xì)胞的Th2 和Th17細(xì)胞亞群亦在BA的病理變化中發(fā)揮重要作用[17～19]；②LFA-1可調(diào)節(jié)Th1/Th2/Th17 CD4+T細(xì)胞亞群間的平衡狀態(tài)，調(diào)控自身免疫性疾病的發(fā)生[20]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)BA患兒CD4+T細(xì)胞的ITGAL基因啟動(dòng)子區(qū)處于相對(duì)高的甲基化狀態(tài)，不同于其他自身免疫性疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)中的低甲基化狀態(tài)[21]。考慮可能與BA的發(fā)病因素較為復(fù)雜，或可能是受其他表觀遺傳因素(如乙?；?、磷酸化、泛素化及蘇素化等[22,23])的影響，值得進(jìn)一步深入研究。

5-氮雜胞苷是核苷類DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，其機(jī)制是核苷類似物轉(zhuǎn)變成脫氧核苷三磷酸，代替胞嘧啶進(jìn)入復(fù)制的DNA分子。這些物質(zhì)只在細(xì)胞S期具有活性，具有很強(qiáng)抑制DNA甲基化的作用。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合在被修飾DNA分子的堿基上，形成去甲基化的DNA分子。本研究采用5-氮雜胞苷干預(yù)T細(xì)胞，比較干預(yù)與否對(duì)ITGAL甲基化水平和mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，使用5-氮雜胞苷干預(yù)后，CD4+和CD8+T細(xì)胞ITGAL基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平降低，mRNA表達(dá)升高，反證了未予5-氮雜胞苷干預(yù)的ITGAL基因調(diào)控序列出現(xiàn)了高甲基化，導(dǎo)致mRNA表達(dá)下降。有研究指出，CD4+和CD8+T細(xì)胞ITGAL基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平降低可能導(dǎo)致ITGAL基因轉(zhuǎn)錄增加，進(jìn)而引起ITGAL基因表達(dá)增加，這種調(diào)控可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平[24～26]。

結(jié)論：本研究提示，BA患兒CD4+T細(xì)胞ITGAL基因啟動(dòng)子區(qū)存在高甲基化狀態(tài)，可能是造成宿主對(duì)病毒易感性增加的主要因素。

本研究的不足之處：①由于研究時(shí)間較短，納入的樣本量較局限；②CD4+和CD8+T細(xì)胞有許多不同的亞群，可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定影響；③不能說(shuō)明乙?；?、磷酸化、泛素化及蘇素化等因素是否也對(duì)BA基因起調(diào)控作用。

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