HPLC測定玄參中哈巴俄苷和肉桂酸

龍 瀾,帥超群

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)創(chuàng)新中心鄂西綜合實驗站，湖北 恩施 445000； 2.恩施清江生物工程有限公司，湖北 恩施 445000)

玄參屬玄參科植物玄參(ScrophularianingpoensisHemsl)[1]的根據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載,玄參具有滋陰、降火、生津、涼血、解毒等功效.用于目赤、癰腫瘡毒、熱病傷陰、舌絳煩渴等癥.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，玄參還具有抗炎[2]、抗菌[3-4]、保肝用抗氧活性[5]、降壓[6]、免疫促進[7]和鎮(zhèn)痛[8]等作用.采用反相高效液相色譜法, 比較了不同產(chǎn)地玄參中哈巴俄苷和肉桂酸的含量, 現(xiàn)將結(jié)果介紹如下.

1 儀器與試藥

Waters高效液相2996；Waters 2996 PD二級管陣列檢測器；KQ-250D型超聲波清洗器；哈巴俄苷、肉桂酸對照品(成都普思生物科技有限公司，批號：Ps08060501，Ps08092502)，色譜乙腈，去離子水，甲醇、乙酸乙酯，丙酮等試劑均為分析純，玄參樣品采自湖北巴東、湖南龍山、重慶南山、貴州道真、陜西鎮(zhèn)平.

表1 流動相梯度洗脫比例Tab.1 The proportion of gradient in the mobile phase

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:依利特C18色譜柱(4.6×200 mm，5 μm)，流動相:乙腈，1%醋酸溶液，按表1進行梯度洗脫.

流速:1.0 mL·min-1；檢測波長:278 nm；柱溫:25℃，理論板數(shù)按哈巴俄苷峰計算不得低于5 000.

圖1 哈巴俄苷、肉桂酸對照品 圖2 玄參樣品 Fig.1 The reference substance of Arpagoside and cinnamic Acide Fig.2 The sample of Figwort root and Cinnamic Acid

2.2 對照品溶液的制備

取哈巴俄苷，肉桂酸對照品適量，用30%甲醇分別配置成含哈巴俄苷300 μg/mL，肉桂酸500 μg/mL的對照品溶液.

2.3 供試品的制備

精確稱取玄參藥材(粉碎過4號篩) 0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，分別精密加入30%甲醇50 mL、超聲波提取50 min，過濾，定容于50 mL容量瓶中，搖勻，作為供試品.

2.4 線性關(guān)系的考察

取對照品溶液,按照2.1的色譜條件, 分別進樣2、5、10、20、40 μL，以峰面積(A)對濃度(C)回歸分析，得哈巴俄苷標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=15.83x+27.58,相關(guān)系數(shù)r=0.999 91；肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=36.32x+8.97,相關(guān)系數(shù)r=0.999 95；結(jié)果表明,哈巴俄苷和肉桂酸在此條件下呈良好的線性關(guān)系.

表2 添加回收率實驗

2.5 精密度試驗

按照2.1的色譜條件連續(xù)進同一供試品溶液5次，測定哈巴俄苷峰面積的RSD為1.93%，肉桂酸面積的RSD為1.67%.

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按每2 h測定一次，供試品中哈巴俄苷峰面積的RSD為1.21%(n=7) ，肉桂酸峰面積的RSD為1.34%(n=7)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.7 重復(fù)性試驗

取玄參藥材5份，按照2.3的方法平行制備5份供試品，依法測定，計算哈巴俄苷保留時間和峰面積的RSD分別為0.45%，1.32%；肉桂酸保留時間和峰面積的RSD分別為0.39%，1.48%，表明該方法的重復(fù)性較好.

2.8 回收率試驗

取已知含量的玄參樣品約0.5 g，精密稱取5份，分別加入等量的對照品，按照2.3的方法進行處理，計算回收率，結(jié)果見表2.

2.9 樣品的測定

按2.3項下方法操作制得的樣品溶液,進樣20 μL,在278 nm處檢測,玄參樣品圖2的HPLC色譜圖.結(jié)果5 種不同產(chǎn)地玄參中哈巴俄苷、肉桂酸的含量如下表3.

3 討論

1)在對玄參提取溶劑的考察過程中，比較30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯得提取效果，實驗發(fā)現(xiàn)30%甲醇的提取效果是最好的；并對超聲波提取時間進行考察，結(jié)果采用超聲提取50min為最佳方法.

2)通過對哈巴俄苷、肉桂酸的三維掃描，在278 nm處，哈巴俄苷、肉桂酸的吸收較高，且能與雜質(zhì)少.

3)本實驗所建立的測定玄參中哈巴俄苷、肉桂酸含量的方法，準(zhǔn)確度高，操作簡便、準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好、靈敏度高，能準(zhǔn)確檢測玄參中哈巴俄苷、肉桂酸的含量.

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