響應(yīng)面法優(yōu)化平枝栒子多糖提取工藝研究

曾 智,鄭小江,肖 浩,羅興武

(1.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000； 2.湖北省生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)藥用植物資源開發(fā)利用技術(shù)創(chuàng)新基地，湖北 恩施 445000； 3.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

平枝栒子[1-2](CotoneasterhorizontalisDecne)屬于薔薇目(Rosales)，薔薇科(Rosaceae)，平枝栒子屬(Cotoneaster).平枝栒子廣布于我國陜西、甘肅、湖北、湖南、四川、貴州、云南.平枝枸子屬落葉或半常綠匍匐灌木；高不超過0.5 m，枝水平開張成整齊兩列狀；小枝圓柱形，幼時外被糙付毛，老時脫落，黑褐色.葉片近圓形或?qū)挋E圓形，稀倒卵形.花期5～6月，果期9～10月.

近年來，大量研究表明多糖除了有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)、抗衰老、降血糖、抗凝血等[3]作用外，還具有抗氧化與抗病毒活性[4]，且其對機體毒副作用小.因此，對多糖的研究已經(jīng)成為醫(yī)藥界的熱門領(lǐng)域.響應(yīng)面法(response surface methodology)[5]是采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計的工具，與傳統(tǒng)的“正交試驗設(shè)計分析方法”相比，具有試驗周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素交互作用等優(yōu)點[6-7].另外，王獻等[8]分別采用熱水浸提及超聲波提取水溶性茯苓多糖，結(jié)果二者的提取率分別為13.0%和8.6%，表明熱水浸提多糖得率高.因此本實驗中采用熱水浸提、響應(yīng)面的方法來優(yōu)化提取工藝，以期得到最佳的提取工藝條件.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平枝栒子采自于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所(恩施市新塘鄉(xiāng)長嶺崗).

無水乙醇(AR)、苯酚(AR)、濃硫酸(AR)、葡萄糖標準品(AR)、三氯甲烷(AR)、正丁醇(AR).

1.2 儀器與設(shè)備

FA-1004B電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HWS12數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；低速大容量多管離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外可見分光光度計TU-1810北京普析通用儀器有限責(zé)任公司.

表1 浸提溫度對多糖提取率的影響

表2 浸提時間對多糖提取率的影響

1.3 方法

1.3.1 多糖提取工藝流程 平枝栒子→干燥→粉碎→浸提→定容→醇沉→去蛋白→取1 mL→測吸光度.

1.3.2 提取工藝的主要步驟 精確稱取平枝栒子粉末0.5 mg置于50 mL的燒杯中，加入一定體積的蒸餾水，在一定溫度下水浴一段時間，4 800 r/min離心30 min取上清液定容至25 mL，取5 mL加入3倍體積的無水乙醇于4℃冰箱中過夜，4 800 r/min離心15 min取沉淀定容至10 mL，加入sevage試劑2.4 mL去蛋白，然后取1 mL溶液測其吸光度.

1.3.3 多糖含量與提取率的測定

1.3.3.1 測定方法 多糖含量與提取率的測定：采用苯酚-硫酸法[9-12].精密吸取上述去蛋白后的樣品液1.0 mL，加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，然后加入5 mL 98%的濃H2SO4.搖勻后在40℃水浴中反應(yīng)15 min，再在冷水中冷卻10 min，在480 nm下測其吸光度.

1.3.3.2 標準曲線繪制 精密稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖標準品10.00 mg，置于小燒杯中用蒸餾水溶解，再定容至25 mL，搖勻，即配得葡萄糖標準溶液.取7支干凈的試管，分別精密吸取葡萄糖標準溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別加入蒸餾水補至2.0 mL，按上述方法分別加入新鮮配制的5%苯酚溶液[13]1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后置40℃水浴中加熱15 min，取出置冷水中冷卻10 min，用分光光度計在波長480 nm處測定吸光度，得標準曲線方程：y=0.123 2x-0.000 3，R2=0.999 3.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 浸提溫度對平枝栒子多糖提取率的影響 精確稱取平枝栒子粉0.5 g，每個梯度稱取3份，選取時間2.0 h、料液比1∶12，分別在溫度為50、60、70、80、90、99℃提取，測得平枝栒子多糖得率如圖1中所示.

2.1.2 時間對平枝栒子多糖提取率的影響 精確稱取平枝栒子粉0.5 g，每個梯度稱取3份，在溫度為90℃、料液比1∶12的條件下，各樣品分別提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，結(jié)果見表2.

2.1.3 料液比對平枝栒子多糖提取率的影響 精確稱取平枝栒子粉0.5 g，每個梯度稱取3份，在溫度90℃、提取時間2.5 h，各樣品料液比分別為1∶8、1∶12；1∶16、1∶20、1∶24、1∶28，結(jié)果見表3.

表3 料液比對多糖提取率的影響

表4 響應(yīng)面試驗因素水平表

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件

根據(jù)Box-benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理[5]，綜合各單因素實驗結(jié)果，以提取溫度、料液比、浸提時間為因素，采用響應(yīng)面分析方法進行試驗設(shè)計，試驗設(shè)計見表4.

對浸提時間、溫度、料液比作如下變換：X1=(T-90)/9，X2=(z-20)/4，X3=(t-2.5)/0.5，以三次試驗所得多糖提取率的平均值為響應(yīng)值(Y)，設(shè)計試驗與設(shè)計結(jié)果見表5，15個試驗中，1～12是析因試驗，13～15是中心試驗，用來估計試驗誤差.

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理

所得結(jié)果，用響應(yīng)面分析軟件分析得到如下的結(jié)果：

表6 Y的估計回歸系數(shù)結(jié)果

表7 回歸方程的方差分析

由表6結(jié)果可知：溫度、浸提時間的一次方及其二次方、料液比的二次方對平枝栒子多糖的提取率影響都極顯著(P<0.01).

通過軟件分析結(jié)果得到平枝栒子多糖得率為響應(yīng)值的最優(yōu)方程為：

其中X1=(T-90)/9，X2=(t-2.5)/0.5，X3=(z-20)/4.

回歸方程中各變量對指標(響應(yīng)值)影響的顯著性是由F檢驗來判定的，概率P越小，相應(yīng)變量的顯著性就越高.由表6可知，各因素的一次項及二次項對響應(yīng)值的影響都是極顯著的，交互項X2X3是顯著的.同時由表7也可以看出，回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.093 068/0.093 266=99.78%，回歸方程也是極顯著的.因此，該回歸方程可以用來描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，進而確定平枝栒子多糖提取的最佳條件.對回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，整理可得如下三式：

0.046-0.094X1=0

(1)

0.019-0.108X2-0.035X3=0

(2)

0.040-0.176X3-0.035X2=0

(3)

聯(lián)立上述式(1)～(3)解方程組得:X1=0.489,X2=0.109,X3=0.206,代入X1=(T-90)/9，X2=(t-2.5)/0.5，X3=(z-20)/4,分別得到浸提溫度T=94.4℃、料液比1∶20.824、浸提時間2.099h.但考慮到實際操作的便利，將其最佳提取工藝條件修正為提取溫度94℃，料液比1∶21，浸提時間2.1h.

根據(jù)所得結(jié)果，由響應(yīng)面分析軟件得到如圖1～3.

從圖1～3上可以形象地看出各因素的交互作用對響應(yīng)值(多糖得率)的影響.根據(jù)以上Box-benhnken的中心組合試驗，得到平枝栒子的最佳提取工藝條件為：提取溫度為95℃，料液比為1∶21，浸提時間2.1h.

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Box-Benhnken設(shè)計及響應(yīng)面分析，建立了響應(yīng)值與各因素之間的數(shù)學(xué)模型，據(jù)此模型可以預(yù)測理論提取率為0.877%.據(jù)此二次回歸模型，確定了平枝栒子多糖的最佳提取工藝：提取溫度為95℃，料液比為1∶21，浸提時間2.1h.按此工藝條件提取平枝栒子多糖，其一次實際提取率可達0.865%.實際得率與理論值相差甚小，說明該模型能夠很好地預(yù)測試驗結(jié)果，可以簡單快速地用來設(shè)計和分析各種與此相關(guān)的試驗.

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