千層塔孢子萌發(fā)研究初報(bào)

韋景楓 陶文丞 鐘 漫 蒙先舉 張聲濤 覃鳳好

(安順市林業(yè)科學(xué)研究所，貴州 安順 561000)

千層塔(HuperziaserratumThunb.),又名蛇足草、蛇足石杉等,為石杉科石杉屬多年生草本植物[1]。千層塔全草入藥,民間主治癰癤腫毒、跌打損傷等[2]。從“千層塔”中提取的生物堿——石杉堿甲是一種高效、可逆、選擇性強(qiáng)的乙酰膽酯酶(AchE)抑制劑,對老年癡呆癥有顯著療效,同時具有抗癌、抑制艾滋病毒、消炎等作用[3]?，F(xiàn)存的該類植物大多生長緩慢，野生狀態(tài)下千層塔的繁殖主要以孢子繁殖為主，孢子萌發(fā)周期長，萌發(fā)后屬地下生配子體，需6～15年才能成熟[4]。不少研究人員曾開展千層塔組織培養(yǎng)研究,利用植物細(xì)胞工程方法生產(chǎn)石杉堿甲。但是,盡管采用了各種滅菌方法,植株總是帶菌,研究發(fā)現(xiàn)千層塔健康植株中生活著內(nèi)生真菌[5]。經(jīng)過表面消毒滅菌處理后的外植體在培養(yǎng)基上生長一段時間,又會被內(nèi)生真菌所污染[6～7]。千層塔孢子數(shù)量較多，是進(jìn)行千層塔植株繁殖的有利條件，作者擬開展千層塔孢子培育研究,尋找一種新的孢子處理、培養(yǎng)方法，進(jìn)行千層塔植株再生，實(shí)現(xiàn)野生資源的保存、開發(fā)和永續(xù)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的千層塔植株于2009年5月采自貴州省雷山縣，種植于安順市林科所試驗(yàn)場以供實(shí)驗(yàn)取材。取孢子囊作為外植體。

1.2 外植體滅菌

外植體首先用自來水沖洗,然后在加有洗滌劑的水中浸洗 ,最后用清水沖洗干凈。滅菌時在超凈工作臺上用70%酒精浸泡1min,然后用0.1%升汞滅菌3～4min，用無菌水沖洗4～5次，接種。

1.3 培養(yǎng)方法

把滅菌好的孢子囊先接種在不加激素的MS培養(yǎng)基上。15d后選出未污染和未白化的孢子囊繼代到1/2MS和添加GA32mg·L-1、GA35mg·L-1、GA310mg·L-1的1/2MS培養(yǎng)基上(20g·L-1蔗糖，7g·L-1瓊脂，pH6.0)。光照12h·d-1，光照度為24～30μmol·m-2·s-1，分別放在18～20℃、22～24℃、25～28℃下培養(yǎng)。每隔15d統(tǒng)計(jì)孢子囊的污染率和萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 千層塔的外植體滅菌

采用0.1%升汞溶液滅菌，滅菌時間不同，產(chǎn)生的滅菌效果也不相同。處理外植體2～3min，大部分外植體在3～12d內(nèi)，陸續(xù)出現(xiàn)污染，以真菌污染為主，細(xì)菌和雜菌污染為輔，說明滅菌時間過短，無法將表面污染源殺死；處理外植體4～5min，外植體培養(yǎng)在12d內(nèi)出現(xiàn)的主要是真菌污染，呈紅褐色和灰色等(圖A，B)，污染的外植體很快被菌斑包裹，污染率為22.3%，此時的污染為外植體表面滅菌不徹底；處理外植體6～7min，大部分外植體陸續(xù)發(fā)白死亡，說明滅菌時間過長。

外植體培養(yǎng)43d后有的開始出現(xiàn)綠色細(xì)菌、白色細(xì)菌、綠色細(xì)菌伴有白色細(xì)菌、紅色細(xì)菌、其他細(xì)菌和真菌污染等，細(xì)菌和真菌生長迅速，很快就包裹外植體( 圖C，D，E)，120d統(tǒng)計(jì)污染率為71.2%。此時的污染主要為孢子囊內(nèi)生菌。

總之，千層塔外植體的滅菌十分困難。用0.1%升汞，4～5min是比較好的，最后未出現(xiàn)污染的外植體為6.5%。

2.2 溫度對千層塔孢子萌發(fā)的影響

千層塔孢子分別在18～20℃、22～24℃、25～28℃下培養(yǎng)。在18～20℃下培養(yǎng)的孢子到280d還未萌發(fā)，在22～24℃培養(yǎng)的孢子236d孢子萌發(fā)，在25～28℃下培養(yǎng)的孢子219d孢子萌發(fā)。實(shí)驗(yàn)表明，隨著溫度的升高有利于千層塔孢子的萌發(fā)，在25～28℃孢子萌發(fā)最快。

2.3 GA3對千層塔孢子萌發(fā)的影響

千層塔孢子分別在1/2MS和添加GA32mg·L-1、GA35mg·L-1、GA310mg·L-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)。加GA35mg·L-1的孢子在培養(yǎng)219d后最先萌發(fā)，然后是加GA32mg·L-1的孢子在培養(yǎng)221d后萌發(fā)，加GA310mg·L-1的孢子未觀察到有萌發(fā)的，1/2MS培養(yǎng)基孢子在培養(yǎng)284d后孢子萌發(fā)。實(shí)驗(yàn)表明，GA3對孢子萌發(fā)有促進(jìn)作用，加GA35mg·L-1效果最好，可使孢子提前65d萌發(fā)(圖F)。

3 討論

經(jīng)試驗(yàn)研究，千層塔的孢子已萌發(fā)，最適合孢子萌發(fā)的培養(yǎng)基為：1/2MS+GA35mg·L-1，培養(yǎng)溫度在25～28℃。用千層塔的孢子囊作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)是一種比較好的材料，但孢子萌發(fā)要7個月以上，并且孢子萌發(fā)率較低，形成的配子體又很難分化出孢子體，下一步能否通過愈傷組織和GGB等途徑來形成孢子體有待進(jìn)一步研究。千層塔野生資源的再生較難，用生物技術(shù)的手段對這種珍貴的藥用植物資源進(jìn)行人工繁殖迫在眉睫，千層塔配子體是否含有石杉堿甲，能否從增殖的配子體上采取細(xì)胞培養(yǎng)提取石杉堿甲，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)論證。

[1]丁景和.藥用植物學(xué)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1991:86.

[2]浙江省藥用植物志編寫組.浙江藥用植物志[M].杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社,1980:51.

[3]李軍,韓燕.千層塔中三萜成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1988,23(7):549.

[4]中山大學(xué)生物系,南京大學(xué)生物系.植物學(xué)[M].北京:人民教育出版社,1978:137.

[5]石瑋,羅建平，丁振華,等.千層塔內(nèi)生真菌分離鑒定的初步研究[J].中草藥,2005,36(2):281～283.

[6]馬華升,孫玉強(qiáng),童建新,等.千層塔組織培養(yǎng)中外植體消毒滅菌研究初報(bào)[J].杭州農(nóng)業(yè)科技,2008,(3):15～18.

[7]沈曉霞，俞旭平，盛束軍.千層塔莖尖組織培養(yǎng)滅菌方法的研究[J].中國中藥雜志，2002，27(6)：58.