仙茅藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

李隆云，馬 鵬，喻 強(qiáng)，衛(wèi)瑩芳，鐘國躍，王昌華（.重慶市中藥研究院，重慶市400065；2.重慶市中藥良種選育與評價(jià)工程技術(shù)研究中心，重慶市 400065；.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都市 60075）

仙茅為仙茅科仙茅屬植物仙茅Curculigo orchioides Gaertn.的干燥根莖，其性溫、味苦，有小毒，具有溫腎壯陽、祛寒除濕、益精血、強(qiáng)筋骨、行血消腫之功效。現(xiàn)代研究表明，仙茅具有耐缺氧、耐高溫、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗炎、抗菌、抗癌、抗衰老、提高免疫力和雄激素樣作用等作用[1]。

仙茅主要分布于四川、貴州、云南、廣西、廣東等?。ㄗ灾螀^(qū)），主要含有苷類化合物，其中仙茅苷是其特征性物質(zhì)和活性物質(zhì)。仙茅為野生藥材，因生長年限、采集時(shí)期、生長環(huán)境的差異，導(dǎo)致其質(zhì)量參差不齊，穩(wěn)定性差，不能滿足中藥現(xiàn)代化對藥材內(nèi)在質(zhì)量的要求。據(jù)研究[2]，仙茅藥材均含有仙茅苷，但含量相差較大，如四川產(chǎn)仙茅中仙茅苷含量為0.152%、廣東為0.139%、云南為0.065%、湖南為0.042%、廣西為0.057%、貴州為0.024%。為客觀評價(jià)仙茅藥材質(zhì)量，本文通過對主產(chǎn)地樣品浸出物、總灰分、酸不溶性灰分及水分等藥材常規(guī)理化測定項(xiàng)目進(jìn)行考察，并對不同產(chǎn)地藥材的仙茅苷含量進(jìn)行測定，建立仙茅的現(xiàn)代質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)體系，以期提高仙茅質(zhì)量控制水平，確保仙茅藥材質(zhì)量和臨床療效。

1 儀器與試藥

2690高效液相色譜儀、996PAD二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；KQ-250B超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司，頻率：40 kHz，功率：250 W）；AEG-45SM、AW-220電子天平（日本島津公司）；Z-8000原子吸收分光光度計(jì)（日本日立公司）；AFS-2201原子熒光分光光度計(jì)（北京海光儀器公司）。

仙茅為31批采集于不同產(chǎn)地的野生藥材樣品和11批市售藥材，用小型植物樣品粉碎機(jī)粉碎，過三號篩，備用，所有藥材經(jīng)重慶市中藥研究院秦松云和李泉森副研究員鑒定，均為仙茅科植物仙茅C.orchioides Gaertn.的干燥根莖；仙茅苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：0771-200203）；砷、鉛、汞、鎘、銅的含量測定試劑分別按GB/T5009.11-2003、GB/T5009.12-2003、GB/T5009.17-2003、GB/T5009.15-2003、GB/T5009.13-2003規(guī)定使用優(yōu)級純或分析純；甲醇為色譜純，水為去離子水，其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 仙茅苷的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：TSK-GEL ODS-100s（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%乙酸水（33∶67）；流速：1 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：283 nm；進(jìn)樣量：10 μL。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.仙茅苷對照品；B.仙茅藥材；1.仙茅苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.curculigoside control；B.C.orchioides；1.curculigoside

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取仙茅苷對照品2.4 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配制成濃度為0.48 mg·mL-1的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取仙茅藥材粉末0.5 g（過四號篩），精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入甲醇50 mL，超聲提取60 min，取出，濾過，回收甲醇，殘?jiān)眉状既芙?，溶液? mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取仙茅苷對照品溶液1、2、4、8、10 μL，分別注入液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝862 582.833 4X+20 246.252 4（r＝0.999 6，n＝5）。結(jié)果表明，仙茅苷進(jìn)樣量在0.48～4.8 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液10 μL，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次測定。結(jié)果，RSD＝1.5%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品（含量：1.7 mg·g-1）6份，每份約0.5 g，精密稱定，按100%的比例精密加入對照品適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均回收率為99.97%，RSD＝2%（n＝6）。

2.2 樣品提取條件的考察

2.2.1 提取溶劑的考察 取仙茅藥材3份，各約0.5 g，精密稱定，各置100 mL圓底燒瓶中，分別加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯各50 mL，超聲提取60 min，取出，濾過，回收甲醇，殘?jiān)眉状既芙猓芤褐? mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。吸取上述3種溶液各10 μL，注入液相色譜儀，依法測定，計(jì)算仙茅苷的峰面積。結(jié)果，甲醇、乙醇、乙酸乙酯提取的仙茅苷峰面積分別為1 468 184、1 381 115、1 260 332，表明以甲醇作提取溶劑效果最好。

2.2.2 提取方法的考察 （1）甲醇回流提?。喝∠擅┧幉姆勰ㄟ^三號篩）約0.5 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，精密加入甲醇約50 mL，在70℃左右水浴中加熱回流提取60 min，取出，濾過，濾液置100 mL燒瓶中，濾渣重復(fù)提取30 min，合并濾液，回收甲醇，殘?jiān)眉状既芙?，溶液? mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液（Ⅰ）。（2）甲醇超聲提?。喝∠擅┧幉姆勰ㄟ^三號篩）約0.5 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入甲醇約50 mL，靜置1 h，超聲處理30 min，取出，濾過，回收甲醇，殘?jiān)眉状既芙猓芤褐? mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液（Ⅱ）。（3）甲醇索氏提取：取仙茅藥材粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇50 mL，加熱回流提取至提取液無色，濾過，將濾液轉(zhuǎn)移至100 mL燒瓶中，回收甲醇，殘?jiān)眉状既芙?，溶液? mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液（Ⅲ）。

吸取上述3種供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，依法測定。結(jié)果，3種方法得到的仙茅苷峰面積分別為1 455 137、1 038 865、1 185 500，表明水浴加熱回流能更有效提取，故采用甲醇回流提取法提取。

2.2.3 提取時(shí)間的考察 分別取仙茅藥材約0.5 g，精密稱定，各置100 mL圓底燒瓶中，加入甲醇約50 mL，分別回流提取60、90、120 min。取出，濾過，回收甲醇，殘?jiān)眉状既芙?，溶液? mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。

吸取不同時(shí)間點(diǎn)提取的溶液各10 μL，注入液相色譜儀，依法測定，計(jì)算仙茅苷的峰面積。結(jié)果，提取60、90、120 min后仙茅苷的峰面積分別為1 482 772、1 548 732、1 551 914，表明提取90 min與提取120 min，仙茅苷的峰面積無顯著差異，故以90 min為宜。

2.3 市售藥材理化項(xiàng)目測定

選取11批市售藥材，分別依照2010年版《中國藥典》（一部）項(xiàng)下方法[3]進(jìn)行浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、水分、重金屬及有害元素的限量檢測。

3 結(jié)果

3.1 不同產(chǎn)地藥材中仙茅苷含量測定結(jié)果

藥材中仙茅苷含量在0.2%以上的產(chǎn)地有廣西南丹縣（市售，0.281%）、安徽亳州市（市售，0.274%）、云南文山縣（0.216%）、貴州興義縣趙家溝（0.201%）、四川宜賓市觀音鎮(zhèn)（大，0.218%）、四川宜賓市明威鄉(xiāng)（0.201%）等，仙茅苷高含量區(qū)域分布較廣泛，沒有明顯的地域性；含量在0.15%～0.2%之間的有云南文山縣1（市售，0.184%）、云南文山縣2（市售，0.178%）、四川宜賓市觀音鎮(zhèn)（0.181%）、四川宜賓市觀音鎮(zhèn)（小，0.171%）、四川彭山縣（市售，0.174%）；含量在0.1%～0.15%的有四川彭山縣青年鄉(xiāng)（0.125%）、四川宜賓市（市售，0.128%）、貴州獨(dú)山縣（市售，0.140%）等。以仙茅苷作為仙茅藥材評價(jià)指標(biāo)，四川宜賓地區(qū)的仙茅藥材普遍含量高、品質(zhì)好；云南地區(qū)如文山縣（0.216%）、臨滄市（0.114%）、羅平縣（0.155%）、文山縣醫(yī)院（0.126%）、峨山縣（0.120%）等地仙茅藥材普遍含量較高，品質(zhì)也較好。綜上，全國仙茅藥材的主產(chǎn)地，以四川、云南的仙茅藥材質(zhì)量最好。不同產(chǎn)地仙茅藥材中仙茅苷含量比較見表1。

3.2 市售藥材的理化項(xiàng)目測定結(jié)果

表1 不同產(chǎn)地仙茅藥材中仙茅苷含量比較Tab 1 Comparison of the contents of curculigoside in C.orchioides from different habitats

3.2.1 浸出物含量 11批仙茅藥材的水溶性浸出物含量（冷浸法）為16.44%～38.65%，水溶性浸出物含量以28.00%～35.00%居多，因此，仙茅藥材的水溶性浸出物含量應(yīng)規(guī)定不得低于20.00%為宜。藥材中有四川宜賓市和安徽亳州市兩個(gè)產(chǎn)地的醇浸出物（熱浸法）含量低于7.0%，不符合2010年版《中國藥典》（一部）規(guī)定；仙茅的醇溶性浸出物含量，以云南、廣西的藥材最高，達(dá)14.66%。11批仙茅藥材醚溶性浸出物含量為1.49～2.23%，醚溶性浸出物含量以1.5～2.0%居多。因此，仙茅藥材醚溶性浸出物含量應(yīng)規(guī)定不得低于1.5%為宜。浸出物含量測定結(jié)果見表2。

3.2.2 總灰分、酸不溶性灰分的含量 11批不同產(chǎn)地仙茅藥材的總灰分含量在7.53%～9.73%之間，符合2010年版《中國藥典》（一部）中規(guī)定的不得過10.0%的要求；11個(gè)產(chǎn)地的藥材中有3個(gè)產(chǎn)地的藥材，其酸不溶性灰分含量超過2010年版《中國藥典》（一部）中規(guī)定的不得過2.0%的要求，大部分批次藥材的質(zhì)量符合規(guī)定?？偦曳帧⑺岵蝗苄曰曳值暮繙y定結(jié)果見表2。

3.2.3 水分 仙茅藥材含水量最高達(dá)16.9%，最低為13.8%，均不符合2010年版《中國藥典》（一部）規(guī)定的不得過13.0%的要求。水分含量測定結(jié)果見表2。

表2 市售仙茅藥材的理化性質(zhì)測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Physicochemical property of C.orchioides on the market（n＝3）

3.2.4 重金屬含量 對6個(gè)不同產(chǎn)地藥材的重金屬含量檢測結(jié)果表明，仙茅藥材中的重金屬砷、鉛、汞、銅含量符合《藥用植物及制劑綠色藥材進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定，鎘的含量則遠(yuǎn)＞0.3 mg·kg-1的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，仙茅藥材中重金屬鎘超標(biāo)的原因有待進(jìn)一步研究。重金屬含量測定結(jié)果見表3。

4 討論

4.1 色譜條件的考察

試驗(yàn)考察了甲醇-異丙醇-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水、甲醇-水等流動相，其中采用甲醇-異丙醇-水作流動相時(shí)，因異丙醇比重較大，出現(xiàn)柱壓突然升高的現(xiàn)象，故放棄該流動相。以甲醇-0.1%乙酸水（33∶67）作為流動相較好，其目標(biāo)峰峰形尖銳、對稱、不拖尾，以仙茅苷計(jì)算，Rf＝1.65，理論板數(shù)＞8 000， 拖尾因子為1，流動相條件與潘馨等研究結(jié)果相同[4]。

表3 不同產(chǎn)地仙茅藥材中重金屬含量測定結(jié)果（mg·kg-1）Tab 3 Content determination of heavy metal in in C.orchioides from different habitats（mg·kg-1）

4.2 提取條件的考察

文獻(xiàn)報(bào)道仙茅苷可溶于溫水、甲醇、乙醇、正丁醇、醋酸乙酯等溶劑[5]，試驗(yàn)中比較過甲醇、乙醇、醋酸乙酯作為溶媒的方法，結(jié)果以甲醇為佳，故本文采用甲醇回流提取的方法。

4.3 仙茅藥材中仙茅苷含量測定方法的確定

所測不同產(chǎn)地的42份仙茅藥材樣品中仙茅苷含量低于0.10%的有8份，故擬定仙茅藥材按干燥品計(jì)算，含仙茅苷（C22H26O11）不得少于0.10%是可行的。

藥典中仙茅苷含量測定法的流動相為乙腈-磷酸，而本法采用甲醇-水，仙茅苷的出峰時(shí)間比藥典方法慢了1 min左右，但甲醇比乙腈低毒、價(jià)廉，故有推廣價(jià)值。今后應(yīng)對仙茅苷含量測定的提取方法進(jìn)行改進(jìn)，同時(shí)開展仙茅藥材的薄層色譜鑒別和指紋圖譜鑒別研究，建立更全面的質(zhì)量控制指標(biāo)。

仙茅藥材的生長年限越長，植株根莖越大，藥材中的仙茅苷含量就越高。野生仙茅藥材的大小和生長年限不一，故采用野生藥材進(jìn)行不同采收期的研究無法論證本草文獻(xiàn)記載的采收期的合理性。藥材適宜采收期和采收年限的確定，必須通過人工種植，定點(diǎn)、定期的采集，進(jìn)行含量與產(chǎn)量等系統(tǒng)研究方可確定。

[1] 高學(xué)敏.中藥學(xué)（下冊）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：683-684.

[2] 董國明，張漢明.不向產(chǎn)地仙茅藥材薄層層析鑒別及仙茅苷的含量測定[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，1998，15（6）：48.

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄62、附錄53、附錄52、附錄50.

[4] 潘 馨，郭素華.高效液相色譜法測定仙茅中仙茅苷的含量[J].中國藥學(xué)雜志，2002，37（5）：370.

[5] 徐俊平，董親頤.仙茅化學(xué)成分研究[J].中草藥，1986，17（6）：9.