銀杏葉提取物對(duì)慢性阻塞性肺疾病模型大鼠ET-1、TGF-β1的影響

劉 忠（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，錦州市 121001）

慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary disease，COPD）的患病率和死亡率不僅在我國(guó)而且在全球范圍內(nèi)均呈上升趨勢(shì)。其中肺動(dòng)脈高壓是COPD最常見的并發(fā)癥，也是臨床防治的難點(diǎn)之一，其發(fā)病機(jī)制與低氧、炎癥、內(nèi)皮損傷等多種因素有關(guān)。近年來，銀杏葉提取物（Ginkgo biloba extract，EGb）已應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療，取得了一定的療效，EGb可以在一定程度上減輕氣道的炎癥和改善氣道的重構(gòu)[1]。本研究選擇熏吸香煙加氣管內(nèi)注射脂多糖（Lipopolysaccharicle，LPS）法[2]復(fù)制COPD大鼠模型，應(yīng)用光鏡、電鏡觀察COPD模型大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化，并測(cè)定EGb治療前后大鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中內(nèi)皮素-1（ET-1）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）水平變化、氣道炎癥細(xì)胞數(shù)量變化，以探討EGb對(duì)COPD模型大鼠氣道炎癥是否具有抑制作用，為臨床應(yīng)用EGb治療COPD提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

800型離心沉淀機(jī)（上海手術(shù)器械十廠）；Ⅲ型超薄切片機(jī)（瑞典LKB公司）；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡（日本電子公司）；BX40型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；CIAS-1000型細(xì)胞圖象分析系統(tǒng)（北京大恒圖象視覺有限公司）；7170A型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）。

1.2 試藥

香煙為烤煙型無濾嘴大前門牌（上海卷煙廠，焦油量：15 mg，煙氣煙堿量：1.1 mg）；LPS（美國(guó)Sigma公司）；酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒和放射免疫試劑盒（天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司）；EGb（北京雙鶴高科天然藥物有限責(zé)任公司，批號(hào)：20100712）。

1.3 動(dòng)物

健康SD大鼠48只，鼠齡4～8周，體重（210±20）g，♀♂兼用，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（遼）2003-2007）。

2 方法

2.1 復(fù)制模型和分組、給藥

實(shí)驗(yàn)分為3組，即正常對(duì)照（將大鼠于第1、14天氣管內(nèi)注入0.9%生理鹽水0.2 mL，第8天起每天ig 0.9%生理鹽水0.05 mL·kg-1）、COPD模型[將大鼠于第1、14天氣管內(nèi)注入LPS 200 μL（1 μg·μL-1），第2～13、5～28天在自制吸煙染毒箱（70 cm×50 cm×50 cm，右上方帶有1.5 cm×1.5 cm通氣孔）內(nèi)熏香煙2次/d，吸煙量為14支/次，其中每次吸煙時(shí)間1 h，2次間隔為1 h；第8天起每天ig 0.9%生理鹽水0.05 mL·kg-1，至第28天處死]和EGb（氣管內(nèi)注入LPS和熏香煙過程同COPD模型組，第8天起每天ig EGb 200 mg·kg-1，至第28天處死）組。

2.2 BALF的采集

將大鼠用2%的戊巴比妥（25 mg·kg-1）麻醉后仰臥固定于操作臺(tái)，切開胸部，暴露出氣管和雙肺，結(jié)扎右主支氣管，在隆突上用套管針穿刺至左肺，緩慢注入無菌生理鹽水3 mL，每次注入后立即回吸得到BALF，重復(fù)3次。灌洗液以紗布過濾，回收率為60%～70%。吸取1 mL BALF置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上，計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)和分類。余BALF于4℃、1 500 r·min-1離心10 min，取其上清液置入離心管，－20℃貯藏，備用。

2.3 ET-1、TGF-β1的檢測(cè)

應(yīng)用ET-1、TGF-β1檢測(cè)試劑盒，按說明書用放射免疫法檢測(cè)BALF中ET-1水平，用ELISA法測(cè)定BALF中TGF-β1的濃度。

2.4 病理標(biāo)本制備和形態(tài)定量分析

取每只大鼠的隆突上2～3 mm處的氣管和中葉肺組織5 mm3，10%福爾馬林固定，酒精梯度脫水，浸蠟，包埋，切片，HE染色，光鏡觀察。將經(jīng)過4%戊二醛固定的1 mm3右肺組織漂洗，用2%四氧化鋨固定，丙酮梯度脫水，包埋，聚合；切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛電子染色，透射電鏡觀察。每張切片均選取上、中、下、左和右5個(gè)視野，用高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析軟件對(duì)HE染色標(biāo)本分別測(cè)量下列指標(biāo)，測(cè)量時(shí)避開支氣管和大、中血管：（1）肺平均內(nèi)襯間隔（Mean lung internal lining interval，MLI）：在高清晰度彩色病理圖文報(bào)告分析軟件上，以視野正中為中心劃“＋”字交叉線，計(jì)數(shù)通過該交叉線的肺泡間隔數(shù)（NS），測(cè)出“＋”字線的總長(zhǎng)度（L）為2.552×10-3m，以MLI＝L/NS得到MLI，其數(shù)值反映肺泡平均直徑。（2）平均肺泡數(shù)（Mean alveoli numbers，MAN）：計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的肺泡數(shù)（Na），測(cè)出每個(gè)視野的面積（S）為0.39×10-6m2，以MAN＝Na/S計(jì)算各個(gè)視野的MAN，其數(shù)值反映肺泡密度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 光鏡觀察

正常對(duì)照組大鼠肺組織氣道黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列整齊，管壁規(guī)整未見增厚，支氣管黏膜下未見明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)未見滲出物，肺泡結(jié)構(gòu)連續(xù)，肺泡壁完整，肺泡腔未見病理性擴(kuò)大，肺間質(zhì)血管未見充血；COPD模型組大鼠小支氣管部分上皮脫落，支氣管腔內(nèi)可見黏液栓和大量炎細(xì)胞，管壁及其周圍有明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)，呼吸性細(xì)支氣管破壞，管腔部分閉塞，肺泡壁變薄甚至破裂，肺泡腔不規(guī)則擴(kuò)大，有的肺泡相互融合成肺大泡，肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生；EGb組大鼠肺組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，支氣管黏膜上皮纖毛脫落及肺泡壁變薄、斷裂等損傷現(xiàn)象均較COPD模型組明顯減輕。大鼠肺組織光鏡下形態(tài)見圖1。

3.2 電鏡觀察

圖1 大鼠肺組織光鏡下形態(tài)（HE染色，40×）A.正常對(duì)照組；B.COPD模型組；C.EGb組Fig 1 Pulmonary morphology of rats in each group under light microscope（HE staining，40×）A.normal control group；B.COPD model group；C.EGb group

正常對(duì)照組大鼠氣道、支氣管黏膜上皮細(xì)胞纖毛排列整齊，無脫落，肺泡上皮細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，肺氣血屏障結(jié)構(gòu)完整，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞無腫脹及空泡樣變；COPD模型組大鼠Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞腫脹和脫落，杯狀細(xì)胞分泌增加，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增生，板層小體排空，線粒體腫脹，呈空泡樣變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核固縮，表面纖毛減少脫落，肺泡腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞溶酶體增多；EGb組大鼠Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞腫脹、脫落和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞線粒體腫脹、板層小體排空等損傷有所改善。大鼠肺組織電鏡下形態(tài)見圖2。

圖2 大鼠肺組織電鏡下形態(tài)（10 000×）A.正常對(duì)照組；B.COPD模型組；C.EGb組Fig 2 Pulmonary morphology of rats in each group under electron microscope（10 000×）A.normal control group；B.COPD model group；C.EGb group

3.3 肺組織形態(tài)學(xué)定量分析

與正常對(duì)照組比較，COPD模型組MLI顯著升高，MAN顯著降低（P＜0.01）；與COPD模型組比較，EGb組MLI顯著降低，MAN顯著升高（P＜0.05）。大鼠肺組織形態(tài)學(xué)定量分析結(jié)果見表1。

表1 大鼠肺組織形態(tài)學(xué)定量分析結(jié)果（±s，n＝16）Tab 1 Result of morphologic quatitative analysis of lung tissue in rat（s±s，n＝16）

表1 大鼠肺組織形態(tài)學(xué)定量分析結(jié)果（±s，n＝16）Tab 1 Result of morphologic quatitative analysis of lung tissue in rat（s±s，n＝16）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與COPD模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.COPD model group：#P＜0.05

MAN/（×106個(gè)/m2）405.33±25.46 283.20±17.81＊313.59±24.28#組別正常對(duì)照組COPD模型組EGb組MLI/（×106個(gè)/m2）51.24±8.37 91.67±16.81＊77.96±9.81#

3.4 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類計(jì)數(shù)和ET-1、TGF-β1水平的變化

與正常對(duì)照組比較，COPD模型組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞（PMN）數(shù)顯著增加（P＜0.01），ET-1、TGF-β1濃度顯著升高（P＜0.01）；與COPD模型組比較，EGb組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和PMN數(shù)顯著下降（P＜0.05），ET-1、TGF-β1濃度顯著降低（P＜0.05）。大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、分類計(jì)數(shù)和ET-1、TGF-β1水平變化見表2。

表2 大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、分類計(jì)數(shù)和ET-1、TGF-β1水平變化（±s，n＝16）Tab 2 Result of the level of ET-1 and TGF-β1，the total counts and differential counting of WBC in BALF of rat（s±s，n＝16）

表2 大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、分類計(jì)數(shù)和ET-1、TGF-β1水平變化（±s，n＝16）Tab 2 Result of the level of ET-1 and TGF-β1，the total counts and differential counting of WBC in BALF of rat（s±s，n＝16）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與COPD模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.COPD model group：#P＜0.05

組別正常對(duì)照組COPD模型組EGb組TGF-β1/μg·L-1 1.62±0.46 5.66±0.35＊3.25±0.69#細(xì)胞總數(shù)/（×108個(gè)/L）1.73±0.83 6.50±0.72＊3.21±0.89#PMN數(shù)/（×108個(gè)/L）0.113±0.041 1.570±0.360＊0.543±0.213#PMN/%6.09±2.95 24.95±5.99＊17.19±5.49#ET-1/ng·L-1 66.7±10.55 129.33±12.67＊104.69±10.82#

4 討論

COPD是一組氣流受限為特征的肺部疾病，氣流受限不完全可逆，呈進(jìn)行性發(fā)展，但可預(yù)防和治療[3]。其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，目前普遍認(rèn)為，COPD以氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為特征，這種慢性氣道炎癥是由非常復(fù)雜的相互作用的細(xì)胞因子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的[4]。

本研究通過熏吸香煙加氣管內(nèi)注射LPS法復(fù)制COPD大鼠模型，結(jié)果顯示，COPD模型組大鼠的氣道、支氣管有明顯的慢性支氣管炎特征性病理改變，肺組織出現(xiàn)局限性肺氣腫，肺泡隔斷裂、融合，周圍纖維細(xì)胞增生。同時(shí)，圖像分析系統(tǒng)提示，COPD模型組MLI較正常對(duì)照組增高，而MAN較正常對(duì)照組降低，兩指標(biāo)的差異顯著，說明模型復(fù)制成功。

本研究表明，COPD模型組大鼠BALF中ET-1、TGF-β1的濃度、白細(xì)胞總數(shù)和PMN數(shù)均較正常對(duì)照組顯著增高（P＜0.01），提示COPD的氣道炎癥與支氣管肺局部ET-1、TGF-β1的水平增高密切相關(guān)。ET-1是一種生物活性多肽，其在肺部有著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，不僅有收縮氣管、支氣管和血管平滑肌以及促平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增生作用，而且還有促進(jìn)腺體分泌、炎性介質(zhì)釋放等多種作用。肺臟既是內(nèi)皮素作用的靶器官，又是ET-1合成、分泌、代謝的主要場(chǎng)所。有研究表明，組織缺血、缺氧及酸中毒情況下，ET-l釋放增多，且機(jī)體對(duì)其反應(yīng)性增強(qiáng)，同時(shí)促使血管內(nèi)皮強(qiáng)烈收縮[5]。TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞層破壞、氣道炎癥、平滑肌細(xì)胞增殖、杯狀細(xì)胞增生以及促進(jìn)血管重構(gòu)等多種細(xì)胞反應(yīng)[6]。TGF-β1主要由嗜酸粒細(xì)胞分泌，成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞均能分泌TGF-β1。在哮喘和COPD患者及急性、亞急性和慢性哮喘小鼠模型的上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn) TGF-β1的過度表達(dá)[7，8]。本文結(jié)果提示，COPD的氣道炎癥與支氣管肺局部ET-1、TGF-β1的濃度呈顯著正相關(guān)，可能ET-1釋放增多致血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生缺血性壞死，從而使血管內(nèi)皮細(xì)胞本身釋放TGF-β1增加，而TGF-β1能夠通過促使杯狀細(xì)胞增生，誘導(dǎo)釋放ET-1導(dǎo)致血管重塑，促進(jìn)氣道平滑肌的增生肥大、遷移以及破壞上皮細(xì)胞層等多種途徑參與氣道重塑[9]。結(jié)果表明，ET-1、TGF-β1參與了COPD氣道炎癥反應(yīng)和氣道結(jié)構(gòu)的重塑。

EGb是從銀杏葉中提取的具有獨(dú)特藥理活性的化合物，主要化學(xué)成分有黃酮類、萜類、酚類等。研究報(bào)道，EGb具有清除自由基，改善血液流變學(xué)及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，抗炎，阻止血小板、白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附等作用[10]。本研究利用EGb進(jìn)行干預(yù)，以探討其對(duì)COPD可能的預(yù)防保護(hù)作用。結(jié)果顯示，EGb組大鼠病理學(xué)檢查提示肺組織損傷較COPD模型組減輕。形態(tài)定量分析結(jié)果表明，EGb組MLI較COPD模型組降低，MAN較COPD模型組升高（P＜0.05），說明EGb可以抑制肺泡融合等肺泡結(jié)構(gòu)改變，對(duì)肺氣腫結(jié)構(gòu)的改建起到了一定的防治、緩解作用。同時(shí)研究結(jié)果表明，EGb組大鼠BALF中ET-1、TGF-β1濃度與白細(xì)胞總數(shù)、PMN數(shù)較COPD模型組下降（P＜0.05），提示EGb還可以有效抑制腺泡內(nèi)肺動(dòng)脈血管壁炎細(xì)胞浸潤(rùn)、血管壁平滑肌細(xì)胞增生，抑制肺血管和氣道結(jié)構(gòu)的重塑。

由此可見，本研究中EGb對(duì)大鼠COPD氣道重塑和肺血管重塑均有明顯的抑制作用，筆者推測(cè)其作用機(jī)制可能與抑制氣道、肺組織、肺血管的炎癥反應(yīng)有關(guān)，因?yàn)檠装Y貫穿COPD的整個(gè)發(fā)生發(fā)展過程。鑒于EGb的藥理作用和COPD形成因素的復(fù)雜性，其確切的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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