苯酚-硫酸法測定桂花葉中多糖的研究

林志鑾 陳培珍

（武夷學(xué)院 福建省高校綠色化工技術(shù)重點實驗室，福建省 武夷山 354300）

苯酚-硫酸法測定桂花葉中多糖的研究

林志鑾 陳培珍

（武夷學(xué)院 福建省高校綠色化工技術(shù)重點實驗室，福建省 武夷山 354300）

建立測定桂花葉中多糖含量的方法。采用苯酚-硫酸法，分別考察該方法的測定波長、精密度、準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性。結(jié)果表明，測定波長為490 nm，多糖得率達11.35%，線性方程為Y=8.82012*X-0.13，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9997，精密度為RSD%=2.28%(n=6)，平均標(biāo)準(zhǔn)回收率為98.55%。該方法為桂花葉多糖的測定提供了一種快速簡便的技術(shù)。

桂花；提??；苯酚 -硫酸法

多糖已作為有生物活性的天然產(chǎn)物中的一個重要類型出現(xiàn)，具有的抗腫瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒等多種生物活性、毒副作用小和不易造成殘留等優(yōu)點活性已相繼被發(fā)現(xiàn)[1，2，3]，所以近年來多糖成為天然藥物研究的熱點[4，5，6，7，8]。桂花（Osmanthus fragrans lour)又名木犀、九里香、金栗是我國十大傳統(tǒng)名花之一，桂花富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等，被稱為“全營養(yǎng)食品”[9，10]。關(guān)于桂花葉多糖成分的提取及含量測定的研究尚未見報導(dǎo)。本文用水溶醇析法提取了桂花葉多糖，并采用硫酸-苯酚法[11]對其多糖含量進行了較詳細(xì)的研究，為桂花的深度開發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

葡萄糖 A.R.；苯酚 A.R.；硫酸 A.R.；無水乙醇 A.R.；石油醚 A.R.；氯仿 A.R.；正丁醇 A.R.。桂花葉來自福建武夷山地區(qū)，自然曬干，烘至恒重備用。

標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的配制：在105℃烘干至恒重的葡萄糖，精確稱取0.2000g定容到100mL，即為2.0mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。

紫外可見分光光度計UV-2550（日本島津），恒溫水浴鍋（常州國華），分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），真空干燥箱（上海精宏），自動純水蒸餾器（上海嘉鵬科技有限公司），微型植物粉碎機（天津市泰斯特儀器廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 桂花多糖的提取工藝流程：桂花干葉→粉碎、過篩(60目)→乙醇索氏提取回流至無色→殘渣晾干→水浴浸提4小時→減壓過濾→sevage法脫蛋白→劇烈震蕩→靜置分離→濃縮至15mL左右→乙醇沉淀→減壓過濾→丙酮溶劑洗滌3次→低溫干燥→桂花多糖(備用)

1.2.2 葡萄糖工作曲線的制作：采用苯酚-硫酸法[11]進行測定。

1.2.3 總還原糖含量的測定：將桂花葉多糖濃縮液移到25mL容量瓶中，加蒸餾水定容；取1.0mL該溶液和1.0mL蒸餾水于25mL比色管中，加入6%的苯酚1.0mL，快速加入98%的濃硫酸5.0mL，靜置10min后搖勻，冷卻至室溫，然后在490nm波長處比色，通過葡萄糖質(zhì)量濃度（mg·mL-1）和吸光度（A ）進行回歸，計算桂花葉多糖含量及多糖提取率。

提取率 (%)=總還原糖含量 (g)/原料干重 (g)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

空白溶液調(diào)零后，對葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和桂花葉多糖混合溶液（a），桂花葉多糖溶液（b）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（c）進行200-800nm掃描，結(jié)果經(jīng)比較分析后，取干擾較少、測定穩(wěn)定且靈敏度較高的490nm作為測定波長。如圖1所示。

如圖1為最大吸收波長的確定

2.2 工作曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取葡萄糖0.2000g于100mL容量瓶中定容,即為2.0mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，取2.0mL蒸餾水作為空白樣，依次取0.4、0.8、1.2、1.6、1.8、2.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,用蒸餾水補足2.0mL，在7個樣品中加入1.0mL 6%的苯酚，5.0mL 98%的濃H2SO4，靜置10min后搖勻，流水冷卻到室溫，定容到25mL。然后在490nm波長處比色。實驗表明，在0.016mg·mL-1～0.160mg·mL-1范圍內(nèi)，吸光度（A）與葡萄糖濃度成良好的線性關(guān)系Y=8.82012*X-0.13，R=0.9997。

2.3 檢出限的確定

另外，對 0.016、0.032、0.064 mg·mL-1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進行6次重復(fù)測定，求出每個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)偏差s1、s2、s3，并對三個標(biāo)準(zhǔn)偏差和濃度進行線性回歸分析，得回歸方程S=-0.3094*X+0.00336。當(dāng)X=0時，求得S0=0.00336，3倍的S0即為該方法的最小檢測限。

表1 苯酚硫酸法方法檢出限確定

2.4 精密度試驗

在上述條件下，準(zhǔn)確移取桂花葉多糖樣品1.0mL，平行測定6次，計算6次結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD%=2.28%。表明該方法測定桂花葉多糖精密度良好。

2.5 重現(xiàn)性試驗

上述試驗條件下，精密稱取同一批桂花葉6份，測定桂花葉多糖的吸光度，計算6次結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD%=3.11%。表明該方法測定桂花葉多糖重現(xiàn)性良好。

2.6 樣品加標(biāo)回收率試驗

精確移取1.0 mL桂花葉多糖樣品6份，其中1份為對照，5份分別再準(zhǔn)確移取2.0mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖樣品1.0mL，在上述條件下進行測定。其樣品加標(biāo)回收率在92.55%～114.25%之間。平均值為：98.55%，RSD%=4.77%。

表2 桂花葉多糖樣品加標(biāo)回收率確定

2.7 顯色條件的確定

2.7.1 顯色時間的影響

吸取多糖濃縮液移到25mL容量瓶中，加蒸餾水定容；取1.0mL該溶液和1.0mL蒸餾水于25mL比色管中，加入6%的苯酚1.0mL，混勻，快速加入98%的濃硫酸5.0mL，改變靜置時間，流水冷卻至室溫，然后在490nm波長處比色，測定吸光度,結(jié)果見圖2。由圖2可知，在5 min到30 min顯色較穩(wěn)定，可見時間對顯色的影響不大，10 min吸光度達到最大，故顯色時間選擇10min為宜。

圖2 顯色時間對吸光度的影響

2.7.2 苯酚用量的影響

改變苯酚用量，他條件同2.7.1，測定吸光度，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)苯酚用量達到1.0mL后。吸光度變化相對較小，故選擇1.0mL為宜。

圖3 苯酚用量對吸光度的影響

2.7.3 硫酸用量的影響

改變硫酸用量，他條件同2.7.1測定吸光度,結(jié)果見圖4。由圖4可知,隨著硫酸用量增大,其吸光度也越大，但隨著硫酸的用量增加，吸光度變化率增加減少，故選擇硫酸用量是5.0mL為宜。

圖4 硫酸用量對吸光度的影響

3.2 樣品測定

精確稱取桂花葉粉末0.5000g，按照1.2.1提取流程進行提取樣品，最后將提取出來的桂花葉多糖定容到25 mL，準(zhǔn)確移去1.0ml該提取液，按照1.2.3方法進行測定，平行5次.（結(jié)果見表3）

表5 桂花葉多糖提取與含量測定

4 結(jié)論

本實驗采用水提醇析的方法提取了桂花葉中多糖，采用硫酸-苯酚法進行了糖含量測定，結(jié)果測得桂花葉多糖含量為11.35%，精密度為RSD%=2.28%(n=6)，平均標(biāo)準(zhǔn)回收率為98.55%。從實驗結(jié)果可以看出，用硫酸-苯酚法測定多糖含量，結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，實驗結(jié)果重現(xiàn)性較好，所得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

[1]韋巍,李雪華.多糖的研究進展 [J].國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊,2005,32(3):179-184·

[2]蔣巖.硫酸酯化箬葉多糖抗HIV-1機制的初步研究[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)志,2000,14(1):56-59.

[3]吳華振.植物多糖的藥理作用及應(yīng)用進展[J].實用醫(yī)技雜志,2005,12(7):1803-1804.

[4]申利紅,王建森,李雅等.植物多糖的研究及應(yīng)用進展[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2011,27(02):349-352.

[5]倪福太,莊妍.植物多糖研究進展[J].牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2010,73(04):34-36.

[6]田光輝,劉存芳,辜天琪,等.野生藿香中多糖的提取與測定及抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2010,31(2):249-251.

[7]田光輝.香菇多糖提取工藝的優(yōu)化 [J].延安大學(xué)學(xué)報,2002,21(1):46-47.

[8]CHEN H X,ZHANG M·Antioxidant activities of different fractions of polysaccharide conjugates from green tea(Camellia Sinensis)[J].Food Chemistry,2008(106):559-563.

[9]蔡健,王薇,陳國威,等.桂花黃酮類化合物最佳提取工藝研究[J].糧油食品科技,2005,13(1):16-18.

[10]靳熙茜,汪海波,王楓,等.超聲波輔助提取桂花總黃酮的工藝研究[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報,2009,28(4):21-24,29.

[11]徐晶,姜瑞平,夏光輝,等.苯酚-硫酸法測定金頂側(cè)耳中多糖含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(5):2649-2651.

Determination of Polysaccharide from Leaves of Osmanthus Fragrans Lour.by Phenol-Sulfuric Acid Method

LIN Zhiluan CHEN Peizhen

（Key Laboratory for Green chemical in Chemical Engineering and Technology specialty of Fujian Higher Education，Wuyi College，Wuyishan，F(xiàn)ujian 354300）

The assay of determination of polysaccharide content in leaves of Osmanthus fragrans Lour.was built.By phenol-sulfuric method,determination wavelength,precision,accuracy and stability were discussed.The results showed that the measure wavelength was 490 nm,the polysaccharide content of leaves of Osman thus fragrans Lour.was an average of 11.35%,The linear equation was Y=8.82012*X-0.13,and the correlation coefficient was0.9997 .RSD was 2.28%(n=6)and the average recovery was 98.55%.This method provided a quick and convenient technique for the determination of polysaccharide from leaves of Osmanthus fragrans Lour.

osmanthus fragrans lour；extraction；phenol-sulfuric acid method

R284.2

A

1674－2109(2011)05－0044－04

2011-09-09

武夷學(xué)院校科研基金海西項目 （基金項目：XH201002）；武夷學(xué)院對接南平市產(chǎn)業(yè)發(fā)展科研專項（基金項目：2011DJ10）。

林志鑾（1981-），男，漢族，碩士，助理實驗師，主要研究方向：天然產(chǎn)物提取分離。