酶法合成右旋糖酐及過程調(diào)控研究進(jìn)展*

鄒青松，浦媛媛，王曉，王清，李素霞，陳山

(廣西大學(xué)糖業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣西南寧，530004)

右旋糖酐(dextran，dex)是一種主鏈含α-(1，6)糖苷鍵大于50%的帶支鏈的葡聚糖，根據(jù)生產(chǎn)菌株的不同，支鏈可為 α-(1，2)、α-(1，3) 或 α-(1，4)糖苷鍵鏈，且支鏈所占的比例也大不相同。低分子量右旋糖酐具有良好的藥用價值，《中國藥典(2010版)》收錄的12種與右旋糖酐相關(guān)的藥物，主要用于擴(kuò)增血容量、抗凝血、降低血液粘度和抗貧血等。右旋糖酐結(jié)構(gòu)疏松柔軟，具有較好的水溶性及持水性，也被當(dāng)作保濕劑、增稠劑等應(yīng)用于食品工業(yè)和其它化工行業(yè)［1－2］。

右旋糖酐主要是以蔗糖為底物，由腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides，L．M．)和鏈球菌屬(Streptococcus species)等細(xì)菌分泌右旋糖酐蔗糖酶(dextransucrase，DSase，EC 2.4.1.5)催化合成。DSase 把蔗糖水解成葡萄糖基和果糖后又把葡萄糖基聚合成右旋糖酐，然而由于酶法合成右旋糖酐的區(qū)域均一性以及區(qū)域選擇性等機(jī)理尚不明確［3－4］，合成產(chǎn)物的分子量分布和均一性難以控制，導(dǎo)致后續(xù)分離成本較高。采用酸水解和乙醇分級沉淀的傳統(tǒng)方法所獲得的右旋糖酐產(chǎn)品存在分子量分布范圍寬、酶蛋白殘留和氯元素過多等風(fēng)險，限制了右旋糖酐的臨床應(yīng)用。近年來，膜工藝、基因克隆技術(shù)以及固定化技術(shù)得到了較大的發(fā)展，這些新技術(shù)為右旋糖酐的生產(chǎn)提供了新的理論和技術(shù)支持。

1 酶法合成右旋糖酐的機(jī)理研究現(xiàn)狀

右旋糖酐蔗糖酶(DSase，EC 2.4.1.5)屬于糖酐水解酶70家族(Family 70)，是一種催化合成右旋糖酐的胞外酶。DSase在60多年前已被鑒定，其作用機(jī)理也有相關(guān)研究，目前日本學(xué)者利用單分子力譜法從分子力水平上闡述了右旋糖酐鏈伸長的過程［5］，但DSase三維結(jié)構(gòu)不清晰，其區(qū)域均一性和區(qū)域選擇性機(jī)理還不明確，這成為該酶工業(yè)化生產(chǎn)高品質(zhì)右旋糖酐的一個亟待解決的理論難點［3－4］。

右旋糖酐的酶法合成至少存在2種互有爭議的機(jī)理模型。其一認(rèn)為DSase的C端對右旋糖酐的鏈增長起決定性作用，蔗糖和由蔗糖水解得到的葡萄糖是整個反應(yīng)的引發(fā)劑，并且右旋糖酐鏈增長是基于一單活性位點，并從合成產(chǎn)物非還原端開始的半連續(xù)增長模式［6－7］;另有學(xué)者認(rèn)為，蔗糖和葡萄糖不是引發(fā)劑，而右旋糖酐的增長是基于一單活性位點的從合成產(chǎn)物還原端開始的高度持續(xù)增長模式［8］。右旋糖酐酶法合成的機(jī)理以及模型建立還有待更深一步的研究。

2 右旋糖酐蔗糖酶純化分析及來源優(yōu)化

關(guān)于DSase酶的研究在早期主要集中于原始酶的特性及其純化技術(shù)。隨著研究的進(jìn)一步深入，生產(chǎn)菌的誘變、培養(yǎng)基定向優(yōu)化以及酶的基因改造成為提高DSase酶活力和酶產(chǎn)量的主要技術(shù)手段。

Robyt等［9］以L．M．NRRL B-512FMC-16 為生產(chǎn)菌，以發(fā)酵罐為反應(yīng)場所，在最適條件下可得到酶活達(dá)20～25 IU/mL的DSase，經(jīng)孔徑為0.1μm或切割分子量(MWCO)為100 ku的中空纖維膜濃縮后，得到10g級或更大規(guī)模的比酶活力達(dá)183 IU/g的DSase，且所得的酶在SDS-PAGE分析中為單蛋白質(zhì)條帶。Purama等［10］利用聚乙二醇(PEG)純化 L．M．NRRL B-640 DSase，發(fā)現(xiàn)PEG-1500酶分子片斷純度提高40倍，酶活力達(dá)23 IU/mL。膜分離獲得定向酶分子片斷以及新分離純化材料的應(yīng)用將是純化DSase的一個新方向。

圖1 右旋糖酐鏈增長示意圖［5］

國內(nèi)外對DSase的生產(chǎn)菌株的基因改造已有較多的研究報道(見表1)。研究者主要圍繞獲得更高酶活力和更高生產(chǎn)能力的工程菌以生產(chǎn)含較多α-(1，6)糖苷鍵的右旋糖酐，因為α-(1，6)糖苷鍵含量越高，右旋糖酐水溶性越好，更適于應(yīng)用到醫(yī)藥和食品等行業(yè)。表1數(shù)據(jù)表明，已有研究所得結(jié)果還不甚理想，DSase基因工程研究還有待更新突破。目前，國外已有Pharmacia等企業(yè)能生產(chǎn)出高品質(zhì)的右旋糖酐，國內(nèi)雖有企業(yè)進(jìn)行右旋糖酐生產(chǎn)，但質(zhì)量和國外產(chǎn)品還有較大差距。

表1 右旋糖酐酶法合成菌或酶的優(yōu)化

3 右旋糖酐酶法合成的調(diào)控

右旋糖酐的分子質(zhì)量對其性質(zhì)的影響很大，一般藥用右旋糖酐的分子質(zhì)量為20、40、70 ku，因而除產(chǎn)量外，分子量大小和分子量分布的均一性也是右旋糖酐生產(chǎn)的重要目標(biāo)。另外，藥用右旋糖酐其分子鏈中的α-(1，6)糖苷鍵一般不低于95%，右旋糖酐的支鏈分布也影響其在食品行業(yè)的應(yīng)用，分子結(jié)構(gòu)的控制也是右旋糖酐生產(chǎn)的一個主要技術(shù)指標(biāo)。

3.1 不同底物對右旋糖酐酶法合成的影響

蔗糖不是DSase能催化的唯一底物，反應(yīng)底物不同，DSase合成的產(chǎn)物也不同。Kubik等［19］聯(lián)合使用DSase和右旋糖酐蔗糖酶(Dextranase，Dase)，通過控制二者比例可獲得右旋糖酐或低聚糖等不同產(chǎn)物，當(dāng)DSase:Dase為100∶1時，產(chǎn)物主要為藥用右旋糖酐，當(dāng)二者比例為1∶8時，得到低聚異麥芽糖混合物。當(dāng)蔗糖為單一底物時，DSase只合成右旋糖酐;若蔗糖和甲基-D-葡萄糖酐以1∶4的比例作為底物時，L．M．B-512F僅生產(chǎn)高出空白4%的右旋糖酐［20］。相似的，Kitaoka等［21］研究發(fā)現(xiàn)以下3種情況右旋糖酐的產(chǎn)量會降低:(1)反應(yīng)體系中同時存在較高濃度的蔗糖和麥芽糖;(2)蔗糖消耗完后，體系中仍有高濃度的DSase;(3)存在麥芽糖等受體和以右旋糖酐為底物的受體反應(yīng)。

3.2 反應(yīng)條件對右旋糖酐酶法合成的影響

右旋糖酐酶法合成的調(diào)控主要是以底物濃度、酶量、反應(yīng)溫度和 pH等為調(diào)控參數(shù)。Santos等［22］以1.5 dm3的發(fā)酵罐為反應(yīng)容器探索出L．M．B-512F發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐的最適條件為溫度35℃、pH5.5、初始蔗糖濃度20 g/L，在此條件下酶量可達(dá)40 g/L、酶活力為4.17 IU/mL，右旋糖酐產(chǎn)量為8.17 g/L，當(dāng)蔗糖濃度超過40 g/L時產(chǎn)物和菌難以分離。Kim等［23］研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)隨著蔗糖摩爾濃度增加，L．M．B-512 FMCM DSase生物合成的大分子右旋糖酐(＞106u)逐漸減少，而小分子(＜105u)逐漸增加;溫度對分子質(zhì)量大于106u的右旋糖酐的分子量影響極為有限，但可以影響支鏈的生成率;pH值在4.5～6.0內(nèi)不產(chǎn)生顯著影響(見表2)。Falconer等［24］對這一問題作進(jìn)一步的研究，揭示了在一定條件下右旋糖酐分子量大小與體系中的酶含量成反相關(guān)關(guān)系，而蔗糖濃度和發(fā)酵溫度則與之成正相關(guān)的規(guī)律。

表2 不同條件下合成的右旋糖酐在不同分子量區(qū)間分布的百分?jǐn)?shù)［23］

3.3 固定化技術(shù)對右旋糖酐酶法合成的調(diào)控

原始菌固定于海藻酸鈣小球時會帶入附著于菌的右旋糖酐，導(dǎo)致反應(yīng)過程中固定化小球的溶脹變形甚至破裂［20］，這一問題是固定化技術(shù)生產(chǎn)右旋糖酐的一個突出問題，可通過在固定化過程中添加Dase予以解決。海藻酸鹽是固定化技術(shù)中應(yīng)用最多的固定化材料，但Eupergit C、Eupergit C 250 L、羥基磷灰石以及丙烯酰胺等已被作為新型固定化材料應(yīng)用于右旋糖酐生物合成的研究中。Eupergit C和Eupergit C 250L的固定化效果優(yōu)于海藻酸鈉，在pH 5.4時Eupergit C 250L組的酶比活性達(dá)710IU/g，2天后仍保持固定化初始時期酶活力的40%［25］。羥基磷灰石較前兩者更優(yōu)，其同時固定化DSase和Dase可使酶表現(xiàn)出高比活性和高分散性的特點［26］。而在15%的丙烯酰胺和0.4%的雙丙烯酰胺交聯(lián)劑固定L．M．KIBGE HA1實驗中，發(fā)現(xiàn)90%的游離菌可被固定，生產(chǎn)時間長達(dá)480 h，遠(yuǎn)高于游離菌的144 h，且產(chǎn)物分子量遠(yuǎn)小于游離菌發(fā)酵產(chǎn)物［27］。

國內(nèi)對固定化生產(chǎn)右旋糖酐的研究主要來自合肥工業(yè)大學(xué)。姚日生等［28］在DSase固定化生產(chǎn)右旋糖酐過程中加入Dase以控制產(chǎn)物分子量大小，在最初的2 h可使右旋糖酐的重均相對分子質(zhì)量從8.52×105u降至2.00×105u，但在后續(xù)反應(yīng)時間里，分子量的下降趨于平緩。張洪斌等［29］改進(jìn)了固定化材料配方，以4%海藻酸鈉和1%瓊脂按1∶1(V/V)混合作為載體制備的DSase固定化微球，該固定化酶表現(xiàn)出持續(xù)性的高酶活力，在第6批次時轉(zhuǎn)化率仍可維持在40%左右，并探索得到的固定化操作的最適條件為40℃，pH 5.4。其他研究機(jī)構(gòu)也有固定化生產(chǎn)右旋糖酐的報道，藍(lán)平等［30］發(fā)現(xiàn)活性炭固定L．M．20074的效果較好，在適當(dāng)條件下可以得到產(chǎn)率為81.6%、相對分子質(zhì)量大于40萬的右旋糖酐。

4 總結(jié)與展望

右旋糖酐的生產(chǎn)菌株來源廣泛，生產(chǎn)原料廉價易得，其在醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值，市場前景可觀。目前，右旋糖酐酶法合成機(jī)理尚不明朗，生產(chǎn)技術(shù)有待改進(jìn)。基因技術(shù)的發(fā)展使得右旋糖酐蔗糖酶的來源更加多樣化，其催化產(chǎn)物的品質(zhì)也趨于可控。在國際蔗糖價格不斷攀升的情況下，尋求諸如葡萄糖等價格更低的底物用于右旋糖酐的生物合成是未來的研究方向。以基因改造為基礎(chǔ)，利用葡萄糖生產(chǎn)DSase和右旋糖酐的技術(shù)在15年前已有報道［31－33］，但和以蔗糖為底物的產(chǎn)物相比較，以葡萄糖為底物生產(chǎn)的右旋糖酐對右旋糖酐內(nèi)切酶并不敏感，說明這一類型的右旋糖酐的性質(zhì)與原來已被推廣使用的右旋糖酐有一定的差異，因而開發(fā)能有效利用葡萄糖作為底物發(fā)酵右旋糖酐的新菌株成為亟待突破的技術(shù)點。

目前，大多數(shù)固定化材料都是海藻酸鹽，也有固定化效果更優(yōu)的材料如Eupergit C 250L、丙烯酰胺等，但是丙烯酰胺等是有毒化學(xué)材料，這大大降低了它的實際應(yīng)用價值。因此，安全、穩(wěn)定、高效的固定化材料的開發(fā)也是右旋糖酐生產(chǎn)的技術(shù)發(fā)展方向之一。

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