利用超分子體系模擬生物體G蛋白耦聯(lián)受體型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程

劉寶全，王劍鋒，石太德，范圣第

（大連民族學(xué)院生物化學(xué)工程國家民委－教育部重點實驗室，遼寧大連 116605）

利用超分子體系模擬生物體G蛋白耦聯(lián)受體型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程

劉寶全，王劍鋒，石太德，范圣第

（大連民族學(xué)院生物化學(xué)工程國家民委－教育部重點實驗室，遼寧大連 116605）

以生物體G蛋白耦聯(lián)受體型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程為模擬原型，利用自組裝方法構(gòu)建了具有分子間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的超分子體系。帶正電荷的肽脂質(zhì)分子與人工受體共同形成脂質(zhì)體，乳酸脫氫酶（LDH）（效應(yīng)器）通過靜電作用吸附到脂質(zhì)體上，乳酸脫氫酶的競爭性抑制劑（Cu2+）抑制LDH活性（相對酶活性為11.6%），進而共同組成了一個酶活性處于關(guān)閉狀態(tài)的超分子系統(tǒng)。向超分子體系中加入信號分子——磷酸吡哆醛（PLP）后，PLP通過靜電作用吸附到帶正電荷的脂質(zhì)體表面，并與人工受體形成希夫堿;希夫堿與LDH競爭銅離子，解除銅離子對LDH活性的抑制，恢復(fù)LDH的催化活性，使相對酶活性達到83.0%。實驗結(jié)果表明，超分子體系完成了從信號分子到效應(yīng)器（酶）活性變化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，可以利用超分子體系構(gòu)建調(diào)控酶催化活性的超分子器件。

超分子體系;信號轉(zhuǎn)導(dǎo);乳酸脫氫酶;納米器件

1 G蛋白耦聯(lián)受體型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的仿生設(shè)計

G蛋白耦聯(lián)受體型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程涉及到細胞的生長與分化、細胞凋亡等生理過程，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的熱門領(lǐng)域;信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程主要分為4個環(huán)節(jié):①信號分子激活膜上受體，②激活的受體順次激活G蛋白，③激活的G蛋白順次激活效應(yīng)器，④效應(yīng)器形成（表現(xiàn)）活性;涉及到的主要功能元件有5種:細胞膜、信號分子、受體、第二信使、效應(yīng)器（酶）［1］。

分別設(shè)計與合成相應(yīng)的化學(xué)元件用于替代天然體系（G蛋白耦聯(lián)受體型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)）的功能組分，利用超分子化學(xué)理論與技術(shù)，構(gòu)建G蛋白耦聯(lián)受體型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的仿生系統(tǒng)［2－5］。人工體系與天然體系中功能元件的對應(yīng)關(guān)系總結(jié)于表1。

表1 人工體系與天然體系的對應(yīng)關(guān)系

超分子體系的設(shè)計如圖1。整個體系由5個部分構(gòu)成，即人工脂質(zhì)N+C5Gly2C16（肽脂質(zhì)）形成雙分子膜脂質(zhì)體作為反應(yīng)場，吡哆醛磷酸（pyridoxal 5-phosphate，PLP）為信號分子，人工合成的含活性氨基分子為受體，二價銅離子為信使，乳酸脫氫酶（lactate hydrogenase，LDH）為效應(yīng)器（酶）。

圖1 模擬G蛋白耦聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的人工超分子體系示意圖

2 超分子體系組成元件的構(gòu)建

2.1 試劑

十六烷基溴、十六烷基胺、Boc－Ala、Boc－Gly （Sigma公司）;二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、6－溴己酰氯（東京化成工業(yè)株式會社）;4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）（北京夏斯生物有限公司）;還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽（NADH）（上海藍季科技發(fā)展有限公司，進口分裝）;丙酮酸鈉（Fluka試劑）、L－乳酸脫氫酶（LDH，提取自豬心肌） （Roche Diagnostics GmbH Mannheim，德國）。其他為國產(chǎn)分析純試劑。

2.2 儀器

核磁共振儀Varian Mercury plus 400（美國）， Lambda 25紫外－可見分光光度計（PerkinElmer，美國），Sonifier 250D超聲儀（BRANSON，美國），JEM－2000EX透射式電子顯微鏡（JEOL，日本）。

2.3 肽脂質(zhì)的合成

肽脂質(zhì)的合成路線［6－8］如圖2。最終合成的肽脂質(zhì)——溴化N，N－二－十六烷基－Nα－6－三甲胺基己?；璍－丙氨酰胺（N+C5Ala2C16），其核磁檢測結(jié)果為:1H－NMR（400 MHz，CDCl3，TMS）∶δ0.88［6H，t，J=7.1 Hz，（CH2）13CH3］，1.25－1.35［54H，m，N（CH2）2（CH2）13CH3，（CH3）3N+CH2CH2CH2CH2］，1.36［6H，d，J=6.9 Hz，CHCH3］，1.45－1.53［6H，m，NCH2CH2（CH2）13CH3，（CH3）3N+CH2CH2CH2CH2CH2CO］，1.65－ 1.70［2H，m，（CH3）2NCH2CH2CH2CH2CH2CO］，3.58［2H，t，J=7.7 Hz，（CH3）3N+CH2CH2CH2CH2CH2CO］，3.48［9H，s，（CH3）3N+CH2CH2］，2.24［2H，t，（CH3）3N+CH2CH2CH2CH2CH2CO］，3.11［1H，m，NCH2（CH2）14］，3.25［1H，m，NCH2（CH2）14］，4.78［1H，m，J=7.1 Hz，CHCH3］，7.02［1H，d，J=7.4 Hz，CONH］。

圖2 肽脂質(zhì)合成的技術(shù)路線

2.4 人工受體的合成

人工受體的合成方法與肽脂質(zhì)合成［6－8］相似，只是在第3步合成時，用帶保護基的不同氨基酸與雙十六烷基胺（產(chǎn)物2）反應(yīng)，再通過水解反應(yīng)去除保護基后，即得系列人工受體，其活性基團為氨基。合成的雙十六烷基丙氨酰胺，進行核磁檢測，結(jié)果為:1H－NMR（400 MHz，CDCl3，TMS）: δ0.88［6H，t，（CH2）13CH3］，1.24－1.29［52H，m，NCH2CH2（CH2）13CH3］，1.29［3H，d，NHCHCH3］，1.53［4H，m，NCH2CH2（CH2）13CH3］，3.15［2H，t，NCH2（CH2）14］，3.20［2H，t，NCH2（CH2）14］，3.76［1H，t，NHCHCO］。

2.5 含人工受體的脂質(zhì)體制備［8］

稱取肽脂質(zhì)和人工受體（摩爾比為20∶1）溶于氯仿，氮氣流吹掃下使氯仿?lián)]發(fā)制成薄膜，30℃真空干燥徹底去除殘留氯仿，加入10 mL HEPES緩沖液（10 mmol·L－1），漩渦振蕩5 min，再用杯式超聲儀超聲處理5 min（60 W、脈沖間隔1 s），得到相應(yīng)的混合脂質(zhì)體懸浮液。取混合脂質(zhì)體懸浮液樣品采用質(zhì)量分數(shù)為3%的磷鎢酸溶液負染，透射電子顯微鏡下觀察制備好的脂質(zhì)體狀態(tài)。

2.6 乳酸脫氫酶（LDH）活性的測定

乳酸脫氫酶的底物NADH在340 nm處有強吸收，NADH被LDH氧化成NAD后，特征吸收峰消失;因此，可以通過紫外可見分光光度法測定NADH變化，從而計算LDH的相對活性;LDH相對活性以銅離子存在和不存在時酶促反應(yīng)初速度的比值來度量［6－8］。

3 超分子體系的組裝與功能檢測

3.1 超分子體系的組裝機制

肽脂質(zhì)分子如同磷脂分子一樣，可以制備形成雙分子膜（脂質(zhì)體）結(jié)構(gòu)。本研究所用的肽脂質(zhì)含有類似肽鍵的結(jié)構(gòu)，這些肽鍵在肽脂質(zhì)聚集時，可以通過彼此間的氫鍵，起到穩(wěn)定脂質(zhì)體的作用。人工受體具有長鏈疏水基團，在制備脂質(zhì)體過程中，可直接組裝到脂質(zhì)體中。

在HEPES（pH 7.0）體系中，肽脂質(zhì)N+C5Ala2C16頭部的季銨鹽結(jié)構(gòu)使脂質(zhì)體表面帶有正電荷，可以通過靜電作用吸附帶有負電荷的乳酸脫氫酶。二價銅離子作為乳酸脫氫酶LDH的抑制劑，通過與LDH結(jié)合而聚集到肽脂質(zhì)形成的脂質(zhì)體上;肽脂質(zhì)人工雙分子膜、人工受體、效應(yīng)器分子（LDH）、中間信使（Cu2+）4種組分組裝形成超分子體系。

3.2 信號分子——吡哆醛磷酸（PLP）對超分子體系的識別與結(jié)合

吡哆醛磷酸（PLP）在HEPES（pH7.0）緩沖溶液中帶有負電荷，當PLP與肽脂質(zhì)脂質(zhì)體溶液混合時，由于靜電作用，PLP會吸附到帶有正電荷的脂質(zhì)體表面;PLP和肽脂質(zhì)體的作用特點如圖3。

圖3 信號分子PLP溶液和脂質(zhì)體加PLP溶液的紫外－可見吸收光譜

在圖3中，PLP在HEPES緩沖溶液中有2個吸收峰（如圖3（a）），分別位于325 nm和389 nm，并且在389 nm處吸收更強。單獨的脂質(zhì)體在300 nm至500 nm范圍內(nèi)沒有明顯的吸收峰（如圖3 （b））。當脂質(zhì)體的HEPES緩沖溶液與不同濃度的PLP（HEPES緩沖溶液）混合后，只能檢測到信號分子在395 nm處的特征吸收峰，并且吸收值隨PLP濃度逐漸增加（如圖3（b））。由圖3結(jié)果可知，PLP與帶正電荷的脂質(zhì)體相互作用，造成了PLP在325 nm的吸收峰變化;同時造成389 nm吸收峰紅移到395 nm。

實驗結(jié)果表明，由于靜電作用，PLP會自動向脂質(zhì)體聚集，完成超分子體系的自組裝。

3.3 吡哆醛磷酸（PLP）調(diào)控超分子體系的功能狀態(tài)

在HEPES（pH 7.0）緩沖液條件下，超分子體系中的乳酸脫氫酶（LDH）由于銅離子抑制，其相對活性僅為11.6%，即超分子體系的效應(yīng)器（酶）處于關(guān)閉狀態(tài)（off state）。

向以上體系中加入PLP后，測得LDH的相對活性為83.0%。即加入PLP后，效應(yīng)器（酶）的活性從11.6%上升到83.0%，效應(yīng)器（酶）處于工作狀態(tài)（on state）。

以上實驗結(jié)果表明，PLP可以作為信號分子調(diào)控效應(yīng)器（酶）的活性狀態(tài);達到了利用超分子體系模擬完成生物體系中G蛋白耦聯(lián)受體型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的設(shè)計目標，其調(diào)控過程總結(jié)于圖4。

圖4 利用超分子體系模擬生物體G蛋白耦聯(lián)受體型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程示意圖

Cu2+是LDH的競爭性抑制劑，體系中Cu2+的濃度直接調(diào)控著酶的活性。當體系中不存在信號分子時，Cu2+結(jié)合并抑制LDH的活性，體系處于OFF狀態(tài)（如圖4左側(cè)）。當體系中加入信號分子后，信號分子與受體形成希夫堿，希夫堿與Cu2+形成穩(wěn)定的金屬配合物（如圖4的放大部分）。由于希夫堿與Cu2+結(jié)合能力更強［9］，可以從乳酸脫氫酶LDH上奪取Cu2+，解除Cu2+對LDH的抑制，實現(xiàn)乳酸脫氫酶的激活，使體系處于ON狀態(tài)（如圖4右側(cè)）。

4 結(jié)語

（1）利用超分子體系可以有效進行生物體G蛋白耦聯(lián)受體型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的模擬，通過信號分子來調(diào)控效應(yīng)器（酶）的催化活性。其核心工作是確定生物體系信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的關(guān)鍵元件與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，從化學(xué)生物學(xué)角度設(shè)計與合成對應(yīng)組件，利用自組裝方法構(gòu)建超分子體系模擬并完成人工信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

（2）以構(gòu)建并獲得的超分子體系為基礎(chǔ)，可以開發(fā)出用于酶活性控制的超分子開關(guān)器件，并進一步用于酶工業(yè)的催化控制。

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Investigation of Bio－inspired Signal Transduction in the Supermolecular System

LIU Bao－quan，WANG Jian－feng，SHI Tai－de，F(xiàn)AN Sheng－di
（Key Laboratory of Bio－Chemistry Engineering of the State Ethnic Affairs Commission－Ministry of Education，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China）

A supermolecular system with intermolelular communication activities was constructed，inspired by G－protein mediated cell signal transduction.A cationic peptide lipid，N，N－dihexadecyl－Nα－［6－（trimethylammonio）hexanoyl］－alaninamide bromide（N+C5Ala2C16） and an artificial receptor were synthesized with 1－h(huán)exadecylamine and 1－bromohexadecane as starting material through five steps，including substitution and condensation reactions.A selfassembled supermolecular system was obtained，based on liposome with positive charges.The relative activity of LDH was 11.6%due to the inhibition of Cu2+in the absence of the signal molecules.In that supermolecular system，pyridoxal 5'－phosphate acted as the artificial signal，Cu2+acted as a mediator.When the signal molecule，PLP，was added to the supermolecular system，PLP attached to liposome surface，and reacted with the amino group of the artificial receptor，and formed the Schiff base.The Schiff base could withdraw the copper cation captured by LDH，and led to the recovery of LDH activity，up to 83.0%，which has been inhibited by copper cation ever.The given results showed that the supermolecular system finished the signaltransduction from the signal molecules to the effect enzyme.A series of nanodevice，such as the supermolecular switch，will be created to control the enzyme activities.

supermolecular system;signal transduction;lactate dehydrogenase;nanodevice

O621.14

A

1009－315X（2011）03－0248－05

2011－03－18;最后

2011－03－31

國家自然科學(xué)基金資助項目（20872013）;教育部科學(xué)技術(shù)研究重點項目（2010－263）;國家民委項目（09DL08）;遼寧省教育廳資助項目（2009A154）;大連民族學(xué)院引進人才啟動基金資助項目（20096102）。

劉寶全（1972－），男，蒙古族，遼寧北票人，講師，博士，主要從事肽的功能研究與仿生化學(xué)研究。

（責(zé)任編輯 鄒永紅）