應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化鉚釘菇菌絲體胞外多糖提取工藝

冮潔，劉凱，劉丹華

（大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116605）

應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化鉚釘菇菌絲體胞外多糖提取工藝

冮潔，劉凱，劉丹華

（大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116605）

采用響應(yīng)面法對鉚釘菇菌絲體胞外多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提取液中多糖含量為響應(yīng)值。結(jié)果表明，影響鉚釘菇菌絲體胞外多糖提取的主要因素依次為:提取溫度、料液比、提取時間;獲得的各因素最佳水平為:提取溫度6℃，提取時間5 h，料液體積比1∶4.4。在此優(yōu)化條件下，所得胞外多糖的質(zhì)量濃度為278.86 mg·L－1，比優(yōu)化前提高了20.40%。

鉚釘菇;菌絲體;胞外多糖;提取;響應(yīng)面法

鉚釘菇（Gomphidius rutilus），擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，鉚釘菇科。鉚釘菇俗稱松樹傘、松蘑、肉蘑（東北）。夏、秋季群生或散生于油松（Pinus tabuiaeformis）、馬尾松（P.massoiana）、樟子松（P.sylvestris var.mongolica）等林內(nèi)的地上，與松屬植物形成外生菌根，分布于中國（遼、吉、黑、冀、滇）、日本、歐洲及北美［1－2］。至今很難人工離體培養(yǎng)出子實體。目前，人們已對其生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性、馴化栽培進(jìn)行了初步研究［3－4］，并對其土傳病原菌抑菌性和對重金屬的耐性進(jìn)行了研究［5－6］，但對其菌絲體的液體培養(yǎng)和代謝產(chǎn)物方面的研究較少。筆者首次對鉚釘菇菌絲體的最佳液體培養(yǎng)條件和鉚釘菇菌絲體液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖條件進(jìn)行了研究［7－8］。在此基礎(chǔ)上，本文采用響應(yīng)面法對鉚釘菇液體培養(yǎng)菌絲體所產(chǎn)胞外多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立了提取工藝的數(shù)學(xué)回歸模型，以確定鉚釘菇菌絲體胞外多糖提取工藝的最佳參數(shù)，為進(jìn)一步對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和生物活性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

鉚釘菇（Gomphidius rutilus）購自朝陽市食用菌研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、水1 000 mL，pH自然。

完全培養(yǎng)基:葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、KH2PO40.5 g、MgSO40.5 g、K2HPO41 g、水1 000 mL，pH自然。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 試劑

葡萄糖、瓊脂粉、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、K2HPO4、KCl、CuSO4、CaCl2、Na2HPO4、NaH2PO4、濃硫酸、苯酚、無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇均為分析純或化學(xué)純。

1.2.2 儀器

PL203電子精密天平（梅特勒－托利多儀器有限公司，上海）;DNP－9082電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）;無菌操作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;UV－2000紫外可見分光光度計（龍尼柯儀器有限公司，上海）;THZ－C－1恒低溫氣浴搖床（上海豐盟科技材料有限公司）; PHS－3CpH酸度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）;HH－S水浴鍋（鞏義市英峪儀器一廠）;MLS－3750高壓滅菌鍋（日本三洋）;TDZ5－WS離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化

將保存菌種用接種針接入斜面培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)7 d。

1.3.2 菌絲體液體種子培養(yǎng)

在PDA液體培養(yǎng)基中接入斜面菌體，培養(yǎng)溫度為28℃，150 r·min－1搖床培養(yǎng)5～7 d。

1.3.3 胞外多糖液體發(fā)酵

將PDA液體培養(yǎng)基中的種子液按10%接種量接入完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28℃，150 r· min－1搖床培養(yǎng)5～7 d。將發(fā)酵液過濾去除菌絲體待用。

1.3.4 胞外多糖提取方法

將10 mL發(fā)酵液按試驗設(shè)計進(jìn)行處理，在4℃下進(jìn)行醇析，5 000 r·min－1離心5 min，棄去上清液，沉淀用75%乙醇洗滌（去除還原糖），離心，重復(fù)洗滌2次，再離心，沉淀用60℃蒸餾水溶解10 mL，測定其胞外多糖含量。

1.3.5 胞外多糖測定

采用苯酚－硫酸法［9］。

2 結(jié)果與分析

2.1 應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化鉚釘菇胞外多糖提取工藝的試驗設(shè)計及結(jié)果

以提取液中多糖的質(zhì)量濃度（mg·L－1）為響應(yīng)值，設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)面試驗，試驗因素及水平見表1。運(yùn)用SAS軟件得到3因素3水平的響應(yīng)面試驗設(shè)計表，共15組實驗，響應(yīng)面設(shè)計表及其試驗結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表

表2 響應(yīng)面設(shè)計表及其試驗結(jié)果

2.2 試驗結(jié)果二次回歸模型擬合及方差分析

通過SAS軟件分析表2的試驗結(jié)果，所得回歸方程各變量偏回歸系數(shù)估計值見表3;對實驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見表4。

表3 回歸方程各變量偏回歸系數(shù)估計值

表4 試驗結(jié)果方差分析表

采用二次回歸模型所得的回歸方程為:

方程中的二次項的系數(shù)均為負(fù)數(shù)，表明方程表征的拋物面開口向下（如圖1－圖3），有極大值點(diǎn)。

回歸方程的決定系數(shù)R2=0.959 0，說明回歸方程的擬合程度較好，響應(yīng)值的變化有95.90%來源于所選變量。由表4方差分析得知，回歸模型的F－檢驗極顯著（P＜0.01），說明所擬合的二次回歸方程合適。此模型能解釋反應(yīng)變量Y變化的95.90%的信息，Y的變異系數(shù)為2.010 3。因此，回歸方程較好地描述了各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取條件?；貧w方程的一次項F－檢驗極顯著（P＜0.01），二次項F－檢驗不顯著，交互項F－檢驗不顯著。說明實驗所選3個因素的主效應(yīng)顯著，而各因素之間的交互效應(yīng)較小。從方差分析結(jié)果還可以看出:X1（提取溫度）對響應(yīng)值影響效應(yīng)極顯著（P＜0.01），X2（提取時間）對響應(yīng)值影響效應(yīng)不顯著，X3（料液體積比）對響應(yīng)值影響效應(yīng)極顯著（P＜0.01），影響順序依次為:提取溫度、料液體積比、提取時間。

根據(jù)回歸方程，做響應(yīng)面圖（如圖1－圖3），考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析提取溫度、提取時間、料液體積比對多糖提取效果的影響。圖1、圖2和圖3分別為X1和X2、X1和X3、X2和X3因素之間響應(yīng)面分析的立體圖，它們直觀地反映了各因素交互作用對響應(yīng)值的影響。

圖1 X1（提取溫度）和X2（提取時間）對多糖提取效果的影響

圖2 X1（提取溫度）和X3（料液體積比）對多糖提取效果的影響

圖3 X2（提取時間）和X3（料液體積比）對多糖提取效果的影響

2.3 響應(yīng)面的規(guī)范分析

運(yùn)用SAS對回歸模型進(jìn)行規(guī)范分析，尋找最優(yōu)響應(yīng)區(qū)，結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面的規(guī)范分析

由響應(yīng)面的規(guī)范分析可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)的類型為最大值點(diǎn)，此時Y值為284.47。根據(jù)表1的對應(yīng)值和3個自變量的編碼公式，可計算出3個主要因素的最佳水平值，分別為X1（提取溫度）=6℃、X2（提取時間）=5 h、X3（料液體積比）=1:4.4時，模型預(yù)測的多糖濃度最大值為284.47 mg·L－1。

對預(yù)測的結(jié)果值進(jìn)行重復(fù)性驗證試驗:取10 mL發(fā)酵液，于6℃、料液體積比為1∶4.4的條件下提取多糖，提取時間為5 h，所得平均胞外多糖質(zhì)量濃度為278.86 mg·L－1。這一結(jié)果與預(yù)測值基本一致，說明了回歸模型的合適性，可用于指導(dǎo)生產(chǎn)實踐。

3 結(jié)論

應(yīng)用響應(yīng)面法對鉚釘菇菌絲體胞外多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。鉚釘菇菌絲體胞外多糖提取時，料液的體積比對多糖的提取率影響最大，多糖提取率隨料液體積比的升高而增加;其次影響多糖提取率的因素是溫度，降低溫度有利于多糖的提取;提取時間對提取率的影響較小，但提取時間過短會使多糖不能充分析出，而醇沉?xí)r間過長可能會使部分多糖降解。獲得的各因素最佳水平為:提取溫度6℃，提取時間5 h，料液體積比1∶4.4。在此優(yōu)化條件下，所得胞外多糖的質(zhì)量濃度為278.86 mg·L－1，比優(yōu)化前提高了20.40%。

［1］周崇蓮，韓桂云，周玉芝，等.幾種松樹外生菌根真菌的研究［J］.生態(tài)學(xué)報，1983（2）:103－109.

［2］欒慶書.血紅鉚釘菇研究現(xiàn)狀及開發(fā)利用［J］.食用菌，2002（2）:2－3.

［3］韓桂云，齊玉臣，劉忱，等.溫度、pH對菌根真菌生長影響的研究［J］.生態(tài)學(xué)雜志，1993，12（1）:15－19.

［4］計炳生，劉玉靜.鉚釘菇特性及其馴化栽培初報［J］.食用菌，2001（4）:14－15.

［5］欒慶書，金若忠，云麗麗.血紅鉚釘菇對土傳病原菌抑菌性研究［J］.遼寧林業(yè)科技，2005（6）:13－17.

［6］黃藝，黃志基，范玲.鉚釘菇對重金屬的耐性及其對油松分泌TOC的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2006，25 （4）:875－879.

［7］冮潔，蘭黎雪，宋紅梅.鉚釘菇菌絲體液體培養(yǎng)條件及產(chǎn)胞外多糖的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（20）: 8543－8545.

［8］冮潔，宋紅梅.鉚釘菇菌絲體液體培養(yǎng)產(chǎn)胞外多糖條件的研究［J］.食用菌，2009，31（3）:14－17.

［9］寧慧青.不同食用菌多糖含量的比較研究［J］.山西化工，2007，6（3）:16－18.

Optimization of Extraction Conditions of Exopolysaccharides from
Gomphidius Rutilus Gomphidius Rutilus Using Response Surface Methodology

GANG Jie，LIU Kai，LIU Dan－h(huán)ua
（College of Life Sciences，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China）

The extraction motheds for Gomphidius rutilus mycelium exopolysaccharides were optimized by response surface methodology（RSM）.The results showed that the degree of the factors significantly influencing the yield of polysaccharides was in order of extraction temperature，ratio of liquid to solid，extraction times.The optimum extraction conditions are as follows:the temperature 6℃，extraction time 5 hours and ratio of material to liquid 1:4.4.Under these optimum conditions，the exopolysaccharide obtained was 278.86mg/L，improved 20.40%compared with that before optimization.

gomphidius rutilus;mycelium;exopolysaccharides;extraction;response surface methodology

S646

A

1009－315X（2011）03－0241－04

2010－12－20;最后

2011－01－06

遼寧省教育廳項目（2009A155）;中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)專項資金資助項目（DC10020106）;大連民族學(xué)院太陽鳥項目（20090307）。

冮潔（1965－），女，黑龍江齊齊哈爾人，教授，博士，主要從事食品生物技術(shù)研究。

（責(zé)任編輯 鄒永紅）