黑棘鯛胚胎發(fā)育過(guò)程及特殊結(jié)構(gòu)觀察

官曙光, 劉洪軍, 李祥東, 于道德

(1. 山東省海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島266002; 2. 煙臺(tái)百佳水產(chǎn)有限公司 山東 煙臺(tái) 265715)

黑棘鯛胚胎發(fā)育過(guò)程及特殊結(jié)構(gòu)觀察

官曙光1, 劉洪軍1, 李祥東2, 于道德1

(1. 山東省海水養(yǎng)殖研究所, 山東 青島266002; 2. 煙臺(tái)百佳水產(chǎn)有限公司 山東 煙臺(tái) 265715)

馴化野生黑棘鯛(Acanthopagrus schlegelii)作為親魚(yú), 自然受精, 通過(guò)溢水法收集發(fā)育同步的受精卵。受精卵孵化條件為水溫(21.0±0.5)℃, 鹽度32～33, pH7.8～8.2, 微充氣。在奧林巴斯SZ61解剖鏡下對(duì)黑棘鯛的胚胎發(fā)育進(jìn)行觀察, 并使用CCD圖像傳感器拍照, 描述了各發(fā)育時(shí)期的發(fā)育時(shí)序和形態(tài)特征。黑棘鯛受精卵為圓球形端黃卵, 單油球, 卵膜薄、局部具龜裂結(jié)構(gòu), 卵子直徑0.84～0.98 mm,n=30, 卵黃均勻透明。其胚胎發(fā)育可分為胚盤(pán)形成期、卵裂期、桑椹期、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、器官發(fā)生期、尾芽期、肌肉效應(yīng)期。在水溫(21.0±0.5)℃, 鹽度32～33的條件下, 受精卵歷時(shí)32 h完成孵化。在黑棘鯛胚胎發(fā)育過(guò)程中, 發(fā)現(xiàn)部分卵子具兩個(gè)油球, 卵黃囊膜較脆弱, 心臟附近具有類(lèi)似于柯氏囊的囊泡存在。另外, 高溫(25℃)在大大縮短孵化時(shí)間的同時(shí), 增加了胚胎的畸形率和死亡率。

黑棘鯛(Acanthopagrus schlegelii); 胚胎發(fā)育; 柯氏囊

黑棘鯛(Acanthopagrus schlegelii(Bleeker, 1854)),隸屬鱸形目(Perciformes)、鯛科(Sparidae)、棘鯛屬(Acanthopagrus)[1], 而中國(guó)海水養(yǎng)殖中最常見(jiàn)的鯛科魚(yú)類(lèi), 真鯛(Pagrus major)屬于赤鯛屬(Pagrus)。黑棘鯛的俗稱(chēng)鱺、黑加吉、烏格魚(yú)、海鮒等。為暖溫性底層魚(yú)類(lèi), 喜棲息于砂泥底質(zhì)或多巖礁的淺海, 分布于俄羅斯、中國(guó)、朝鮮半島及日本沿海。黑棘鯛具有生長(zhǎng)迅速、食性較雜、適應(yīng)能力和抗病力強(qiáng)等特點(diǎn), 且肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富, 深受人們喜愛(ài)。自20世紀(jì) 80年代以來(lái),隨著黑棘鯛人工繁殖技術(shù)的突破和苗種培育試驗(yàn)的成功, 在中國(guó)沿海及咸淡水地區(qū), 黑棘鯛的池塘養(yǎng)殖和網(wǎng)箱養(yǎng)殖取得了迅猛發(fā)展,成為中國(guó)重要的海水養(yǎng)殖品種之一[2]。但是黑棘鯛養(yǎng)成周期長(zhǎng), 抗病力差。為了黑棘鯛養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)定與持續(xù)發(fā)展, 由寧波市海洋與漁業(yè)研究院開(kāi)展了真鯛與黑棘鯛的雜交工作[3]。目前, 黑棘鯛主要是作為增殖放流品種而進(jìn)行人工培育, 而對(duì)其胚胎發(fā)育過(guò)程及特殊結(jié)構(gòu)觀察的研究并不多見(jiàn)。

作者對(duì)黑棘鯛的早期發(fā)育和特殊結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)觀察, 取得了其早期發(fā)育大量的生物學(xué)資料, 為進(jìn)一步開(kāi)展黑棘鯛的生物學(xué)研究以及增養(yǎng)殖提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 親魚(yú)來(lái)源

黑棘鯛親魚(yú)為山東省龍口市煙臺(tái)百佳水產(chǎn)有限公司自養(yǎng), 數(shù)量 30尾, 雌雄各半。威海周邊海域捕撈的2～3齡野生黑棘鯛, 通過(guò)自制親魚(yú)餌料進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化和人工生殖調(diào)控促性腺發(fā)育, 培育成熟, 自然產(chǎn)卵。

1.2 受精卵及孵化條件

每天晚上 16:00～17:00為親魚(yú)的產(chǎn)卵高峰期,停氣通過(guò)溢水法用網(wǎng)袋收集受精卵, 利用孵化網(wǎng)箱放入恒溫水池進(jìn)行孵化, 受精卵孵化條件為水溫(21.0±0.5)℃, 鹽度 32～33, pH 7.8～8.2, 微充氣; 初孵仔魚(yú)的培育水溫為(22.0±0.5)℃, 隨仔魚(yú)發(fā)育緩慢升高至23～24℃, 保持此溫度進(jìn)行培育。

1.3 觀察方法

孵化期間定期取樣, 記錄孵化水溫。使用Nikon YS100型顯微鏡和奧林巴斯SZ61解剖鏡觀察胚胎發(fā)育, 記錄發(fā)育各時(shí)期的形態(tài)特征; 使用 CCD圖像傳感器和SONY H-50相機(jī)拍照; 使用DN-2顯微圖像處理軟件, 結(jié)合目微尺、臺(tái)微尺測(cè)定卵徑, 每次觀察胚胎3組, 每組至少30粒左右。發(fā)育時(shí)間的確定按照受精卵50%以上達(dá)到該時(shí)期界定。

2 結(jié)果

觀察結(jié)果顯示, 黑棘鯛卵屬端黃卵, 為單油球的懸浮卵, 呈圓球形、分離透明。卵膜局部具龜裂結(jié)構(gòu), 卵黃均勻無(wú)色。卵徑平均為0.84～0.95 mm。黑棘鯛受精卵行盤(pán)狀卵裂。在水溫(21.0±0.5)℃, 鹽度33的條件下, 受精后 40 min形成胚盤(pán), 受精后 1 h開(kāi)始第一次卵裂, 卵裂期共歷時(shí)5 h 30 min。這段時(shí)期最顯著的特點(diǎn)就是胚盤(pán)的形成帶動(dòng)卵黃囊向上同樣形成一個(gè)尖狀突起。受精后7 h 20 min胚盤(pán)細(xì)胞開(kāi)始下包并內(nèi)卷, 胚胎發(fā)育進(jìn)入原腸胚階段, 此階段是胚體發(fā)育中變化最劇烈的時(shí)期, 在出現(xiàn)胚體雛形的同時(shí)形成神經(jīng)板, 頭部形成眼泡。原口關(guān)閉前, 柯氏囊出現(xiàn)(Kupffer’s vesicle, KV), 色素開(kāi)始形成, 體節(jié)6~8對(duì)。原口關(guān)閉后, 胚胎進(jìn)入器官形成期, 聽(tīng)囊、嗅囊、晶體等依次形成。受精后22 h10 min, 胚體尾芽形成并開(kāi)始脫離卵黃囊, 受精后23 h20 min胚胎開(kāi)始出現(xiàn)微弱心跳; 隨著胚體進(jìn)一步發(fā)育, 心跳加快, 并伴隨著肌體的間歇顫動(dòng)。在受精后32 h, 心率達(dá)到60次/min左右, 胚體發(fā)育進(jìn)入到最后的孵化時(shí)期, 仔魚(yú)主要以頭部首先破膜的方式孵化。其具體的發(fā)育時(shí)序及發(fā)育特征見(jiàn)表1及圖1。

表1 黑棘鯛的發(fā)育時(shí)序及發(fā)育特征Tab. 1 Developmental stages and characteristics of Sparus macrocephlus embryo

圖1 黑棘鯛的胚胎發(fā)育(×32)Fig.1 Embryonic development of Acanthopagrus schlegelii(×32)

3 討論

與大部分海洋真骨魚(yú)類(lèi)類(lèi)似, 黑棘鯛的受精卵也是端黃卵, 行盤(pán)狀卵裂。而且前期大部分過(guò)程: 包括細(xì)胞分裂期、桑椹期、高囊胚、低囊胚以及原口閉合前, 與其他魚(yú)類(lèi)尤其是鯛科的真鯛胚胎發(fā)育并無(wú)差異。在進(jìn)行海洋魚(yú)卵仔魚(yú)調(diào)查的過(guò)程中, 此時(shí)用于區(qū)分不同魚(yú)類(lèi)卵子的主要特征就依賴(lài)于卵徑。當(dāng)胚胎繼續(xù)發(fā)育, 尤其是色素出現(xiàn)后, 開(kāi)始具有種屬的特異性, 黑棘鯛的胚胎發(fā)育色素出現(xiàn)在原口關(guān)閉后, 最終孵化仔魚(yú)的尾部 6體節(jié)出的色素帶成為該種類(lèi)典型的仔魚(yú)特征。

3.1 卵黃囊膜

魚(yú)類(lèi)的卵子具有二層膜結(jié)構(gòu), 外一層為卵膜,內(nèi)層為卵黃囊膜。在對(duì)胚胎進(jìn)行拍照的過(guò)程中, 利用解剖針撥動(dòng)受精卵, 由于卵膜受到壓力變形, 松開(kāi)解剖針后, 卵膜恢復(fù)彈性, 而部分胚胎的卵黃囊膜會(huì)出現(xiàn)破裂(圖 1-26)。作者在進(jìn)行其他海水魚(yú)類(lèi)(真鯛、牙鲆等)的胚胎發(fā)育觀察過(guò)程中, 從未發(fā)現(xiàn)如此脆弱的卵黃囊膜。這種脆性是否也與黑棘鯛第一次繁殖相關(guān), 尚不清楚。

3.2 油球(oil globule, oil droplets)與龜裂結(jié)構(gòu)

海洋魚(yú)類(lèi)的卵子, 根據(jù)物理性質(zhì)有幾種分類(lèi)方法: 黏性和非黏性, 浮性和沉性等。其中根據(jù)油球的有無(wú)可以分為3種類(lèi)型: 單油球浮性卵(60%)、無(wú)油球浮性卵(25%)和多油球浮性卵(15%)[4]。一般來(lái)說(shuō),油球的有無(wú)與卵子的浮性相關(guān), 因?yàn)橛颓虻谋举|(zhì)為脂肪, 比重輕于海水, 因此具有油球的卵子一般都是浮性卵[4-5]。實(shí)際上, 即使是無(wú)油球的卵子也可以在 32%~34%下呈現(xiàn)漂浮狀態(tài), 例如條斑星鰈[6], 這是因?yàn)檫@種卵子在最后成熟階段水化過(guò)程, 吸入大量比重同樣輕于海水的水(體積增加3~6倍)[7], 而呈現(xiàn)上浮特性, 只是不如油球的明顯[8-9]。本實(shí)驗(yàn)觀察了 3批自然受精卵, 其中只有第一批受精卵具有雙油球, 占 15%~20%(圖 1-25), 由于第二個(gè)油球很小,因此應(yīng)該也屬于單油球類(lèi)型。作者在以前進(jìn)行真鯛胚胎觀察的過(guò)程中, 發(fā)現(xiàn)過(guò)類(lèi)似現(xiàn)象, 而且其同批次的卵子中含第2個(gè)油球的比率很高(60%~80%), 據(jù)中國(guó)科學(xué)院海洋研究所李軍教授介紹是由于產(chǎn)卵的真鯛過(guò)于老齡化所致(當(dāng)年的真鯛為13齡, 2007年)。本實(shí)驗(yàn)所用親本為二三齡魚(yú), 不存在老齡化問(wèn)題,可能是第一次繁殖產(chǎn)卵的緣故。因此筆者推斷部分親本應(yīng)該屬于第一次進(jìn)入繁殖期, 具有卵質(zhì)量不穩(wěn)定、出現(xiàn)2個(gè)油球的可能。另外, 具蔣宏雷等[3]報(bào)道的黑棘鯛卵子表面并無(wú)龜裂結(jié)構(gòu), 作者也曾觀察過(guò)真鯛的卵子和胚胎發(fā)育過(guò)程也無(wú)此結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的龜裂結(jié)構(gòu)(圖1-23, 圖1-28)可能是由于第一次繁殖所致。

3.3 關(guān)于柯氏囊

Kupffer[10]在 1868年發(fā)現(xiàn)真骨魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)囊泡。此后為紀(jì)念這個(gè)魚(yú)類(lèi)學(xué)家, 以其名命名這個(gè)器官, 即為柯氏囊(Kupffer’s vesicle)。而關(guān)于柯氏囊的作用一直是個(gè)謎, 也成為魚(yú)類(lèi)胚胎學(xué)家最感興趣的話(huà)題。近年來(lái)研究證實(shí)了柯氏囊啟動(dòng)了魚(yú)類(lèi)的不對(duì)稱(chēng)發(fā)育[11]。不對(duì)稱(chēng)發(fā)育現(xiàn)象普遍存在于脊椎動(dòng)物, 例如人類(lèi)身體左側(cè)的胃、心臟和脾臟;右側(cè)的肝臟就是典型的不對(duì)稱(chēng)發(fā)育器官。

柯氏囊是一個(gè)內(nèi)含單纖毛細(xì)胞(monociliated cells)的器官[12]。這些單纖毛細(xì)胞在柯氏囊的背腹部不對(duì)稱(chēng)分布, 導(dǎo)致內(nèi)液進(jìn)行逆時(shí)針流動(dòng), 正是這種流動(dòng)起始了胚胎發(fā)育的不對(duì)稱(chēng)性[11,13]。作者雖然沒(méi)有對(duì)柯氏囊進(jìn)行深入的研究, 但是在進(jìn)行胚胎觀察的過(guò)程中, 發(fā)現(xiàn)有的胚胎在心臟原基的部位也會(huì)出現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)類(lèi)似于柯氏囊的泡狀囊泡(圖1-27), 由于魚(yú)類(lèi)的心臟是屬于發(fā)生上出現(xiàn)的第一個(gè)不對(duì)稱(chēng)器官, 這種囊泡的存在是否也與柯氏囊的作用類(lèi)似,還需要進(jìn)一步深入研究和探討。

3.4 高溫的致死和致畸作用

類(lèi)似于其他真骨魚(yú)類(lèi), 在一定的溫度范圍內(nèi),胚胎發(fā)育過(guò)程會(huì)隨溫度升高而加快。同時(shí), 在超過(guò)一定范圍的溫度條件下, 會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形和死亡[14-16]。將一部分受精卵于25℃的高溫進(jìn)行孵化, 發(fā)現(xiàn)至少兩個(gè)死亡高峰期, 囊胚期和原腸晚期(或是原口關(guān)閉期), 另外就是強(qiáng)烈的致畸作用: 高溫條件下,魚(yú)類(lèi)過(guò)早達(dá)到胚胎發(fā)育的有效積溫, 而細(xì)胞分裂的速度以及發(fā)生過(guò)程還遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于此, 因此, 很多胚胎在尾芽形成后不久就孵化出膜(圖1-29,1-30)。如上述, 由于卵黃囊膜十分脆弱, 過(guò)早孵化出的仔魚(yú)會(huì)缺乏卵黃囊(卵黃囊膜破裂所致)甚至油球(圖 1-29,1-30)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和本文實(shí)驗(yàn), 可以推測(cè)黑棘鯛胚胎發(fā)育的最佳溫度為18~22℃。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑棘鯛的胚胎發(fā)育過(guò)程的特殊現(xiàn)象,例如卵黃囊膜的脆性, 雙油球的存在以及龜裂結(jié)構(gòu)等, 與以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)論不同, 是否是與初次性成熟相關(guān), 或者受到其他因素影響, 還需要進(jìn)一步的觀察和研究。

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Observation of embryonic development ofAcanthopagrus schlegelii

GUAN Shu-guang1, LIU Hong-jun1, LI Xiang-dong2, YU Dao-de1
(1. Mariculture Institute of Shandong Province, Qingdao 266002, China; 2. Yantai Baijia Fishery Limited Corporation, Yantai 265715, China)

Sep., 25, 2009

Acanthopagrus schlegelii; embryonic development; Kupffer’s vesicle

The naturally fertilized eggs of wild broodstock,Acanthopagrus schlegeliiwere collected by the flooding method in order to obtain developmentally synchronized embryos. The fertilized eggs were incubated in filtered sea water under subtle aerated conditions (salinity 32～33, 21.0 ℃± 0.5 ℃,and pH 7.8～8.2). The ontogenetic embryos were observed by Olympus SZ-61 microscope, the duration of every developmental stage was recorded, and the characteristic images were taken using a charge-coupled device (CCD). The fertilized eggs had globular, single oil globule and thin egg membrane, and the diameters of the eggs were in the range of 0.84 to 0.98 mm (n=30). During embryonic development, the main ontogenetic stages include blastodisc forming stage, cleavage stage, morula stage, blastula stage, gastrula stage, neurulation stage, organogenesis stage, tail bud stage, and heart beating stage. The time-table of major embryonic development stages was as follows: blastodisc forming stage at 40 m post fertilization; 4-cell stage at 1 h and 20min pf; morula at 3 h and 30 m pf; low blastula stage at 6 h 40 m pf; early gastrula stage at 7 h 20 min pf; late gastrula at 13 h pf; blastopore closing stage at 14 h 20 min pf; tail bud stage at 22 h 10 min pf; embryo movement at 28 h pf; 50%hatching stage at 32 h pf. High temperature (25℃) shortened the hatching period, but significantly increased embryo mortality rates and deformity rates.

S917.4; Q959.4

A

1000-3096(2011)09-0068-05

2009-09-25;

2010-05-25

農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目(2011-z39); 山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目

官曙光(1963-), 男, 山東青島人, 碩士, 主要從事魚(yú)類(lèi)學(xué)研究, 電話(huà): 0532-82655167, E-mail: shuguang63@126.com; 于道德,通信作者, 理學(xué)博士, E-mail:wensentte@163.com

梁德海)