潮霉素A的生物合成研究進展

李軍，朱清華，馬俊英，王博，劉靜，張云，鞠建華*

(1.中國科學院海洋生物資源可持續(xù)利用重點實驗室廣東省海洋藥物重點實驗室中國科學院海洋微生物中心中國科學院南海海洋研究所，廣東廣州510301;2.中國科學院研究生院，北京100049;3.德州學院生物系，山東德州253023)

潮霉素A是一種天然的抗生素，1953年第一次從吸水鏈霉菌NRRL 2388的發(fā)酵產(chǎn)物中被分離得到［1］，由5-脫氫-α-L-巖藻糖、(E-3-(3，4-二羥苯基)-2-甲基丙烯酸和2L-2-氨基-2-脫氧-4，5-O-亞甲基肌醇3個結(jié)構(gòu)單元組成。早期的研究顯示，潮霉素A具有廣泛的生物學活性，如抗菌活性［2］(G+、G－)、抗紅細胞凝聚活性和抗密螺旋體活性［3］及免疫抑制活性［4］等。進一步的研究表明，潮霉素A抗菌作用機理為其通過與核糖體50S亞基結(jié)合，抑制核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶，從而抑制蛋白質(zhì)的合成［5］;潮霉素A具有抗紅細胞凝聚活性和抗密螺旋體活性，暗示其在豬密螺旋體引起的痢疾治療方面的潛在應用價值［3］。最新的研究結(jié)果表明其結(jié)構(gòu)類似物(甲氧潮霉素A)具有去除雜草的生物活性［6］。正因為潮霉素A具有新穎的結(jié)構(gòu)特點，良好的生物學活性，獨特的作用機制及潛在應用價值，引起了國內(nèi)外眾多學者對其研究開發(fā)的興趣。本文就潮霉素A的結(jié)構(gòu)特點、生物合成途徑以及生物合成基因的工程改造等方面進行綜述。

1 潮霉素A的化學結(jié)構(gòu)及其類似物

在吸水鏈霉菌NRRL 2388(Streptomyces hygroscopicus NRRL 2388)的發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了潮霉素A(Ⅰ)。從發(fā)酵產(chǎn)物中將其分離，并進行化學手段分析，得出它的化學結(jié)構(gòu)是由3個結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成:5-脫氫-α-L-巖藻糖(結(jié)構(gòu)單元A)［5-dehydro-α-L-fucofuranose］、(E)-3-(3，4-二羥苯基)-2-甲基丙烯酸(結(jié)構(gòu)單元B)［(E)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-methylacrylic acid］和2L-2-氨基-2-脫氧-4，5-O-亞甲基肌醇(結(jié)構(gòu)單元C)［2L-2-amino-2-deoxy-4，5-O-methylene-neo-inositol］［7-8］。在同一發(fā)酵產(chǎn)物中也分離得到了甲氧潮霉素A(methoxyhygromycin A，Ⅱ)，其化學結(jié)構(gòu)見圖1。

利用以潮霉素A為基礎所進行的化學半合成［9］，得到了大量的潮霉素A的結(jié)構(gòu)類似物，比如:5''-二氫甲氧基-潮霉素A［5''-dihydromethoxyhygromycin A，Ⅲ］、5''-二氫潮霉素A(DHHA)［5''dihydrohygromycin A，Ⅳ］和潮霉素A苷元(hygromycin A aglycon，Ⅴ)等。通過化學結(jié)構(gòu)與生物功能之間的關系研究表明氨基環(huán)醇結(jié)構(gòu)模塊是其顯示抗菌活性的藥效基團，而5-脫氫-α-L-巖藻糖模塊則不是其活性的必需基團，它可以被疏水性的烯丙基團所取代。如果(E)-3-(3，4-二羥苯基)-2-甲基丙烯酸模塊中的甲基被丙基或烯丙基等基團所取代的話，整個化合物的抗菌活性會降低。核苷類抗生素A201A(Ⅵ)有著與潮霉素A相類似的結(jié)構(gòu)單元，它也具有廣譜的抗菌活性［10］。

圖1 潮霉素A及其類似物的化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of hygromycin A and its structurally related analogues

2 潮霉素A的生物合成基因簇及其生物合成過程

潮霉素A的相關生物合成基因簇已被成功克隆。潮霉素A的生物合成基因簇約長31.5 kb，有29個開放閱讀框(圖2)，分別命名為hyg1～29，其中包括調(diào)控基因、抗性基因和負責3個結(jié)構(gòu)單元合成的結(jié)構(gòu)基因［11］。通過生物信息學分析，各基因的功能如表1所示。其中，基因hyg1和hyg3是調(diào)控基因;另外幾個基因如hyg6或hyg29、hyg19、hyg21和hyg28，它們分別編碼甲基轉(zhuǎn)移酶、跨膜蛋白、磷酸轉(zhuǎn)移酶、ABC運輸?shù)鞍?，這些蛋白質(zhì)都與菌株本身抵抗潮霉素A的作用有關［12］。

對hyg基因簇進行同源比對及功能分析(表1)后，推測有幾個基因可能參與從NDP-甘露糖到5-脫氫-α-L-巖藻糖的生物合成［13］。hyg5被認為編碼GDP-D-甘露糖-4，6-脫水酶(MDH)，負責催化活化的NDP-甘露糖轉(zhuǎn)化為NDP-4-甲基-6-脫氧甘露糖;潮霉素A合成的重要步驟是NDP-L-巖藻糖的生成，此過程可能由基因hyg23編碼產(chǎn)物所催化，因為hyg基因的推測產(chǎn)物與L-巖藻糖合成酶有超過60%的同源性;接下來是由吡喃六環(huán)糖轉(zhuǎn)變?yōu)檫秽瀛h(huán)糖，這步反應可能由與葡萄糖轉(zhuǎn)移酶同源性很高的基因hyg20編碼的蛋白催化完成［14］;5-脫氫巖藻糖合成的最后一步可能是基因hyg26編碼的脫氫酶來完成。此外，基因hyg16編碼葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，負責5-脫氫-α-L-巖藻糖結(jié)構(gòu)單元和(E)-3-(3，4-二羥苯基)-2-甲基丙烯酸結(jié)構(gòu)單元之間的糖苷鍵的形成。巧合的是，在抗生素A201A的生物合成中也涉及到葡萄糖苷鍵的形成，該反應可能由生物合成基因簇中的結(jié)構(gòu)基因ata5編碼的蛋白催化執(zhí)行的，Ata5蛋白與Hyg16蛋白有63%的相似度［10］。

圖2 潮霉素A的生物合成基因簇的組織結(jié)構(gòu)Fig.2 Organization of hygromycin A biosynthetic gene cluster in Streptomyces hygroscopicus NRRL 2388

表1 潮霉素A生物合成基因簇中各基因的功能［11］Table 1 Deduced functions of open reading frames in the hygromycin A biosynthetic gene cluster［11］

續(xù)表

在結(jié)構(gòu)單元B合成途徑中，涉及到基因hyg9～15、hyg27、hyg4、hyg22。該模塊的合成前體是4-羥基苯甲酸，它由基因hyg4編碼的分支酸裂合酶催化分支酸而得到。分支酸產(chǎn)生于莽草酸途徑，這條途徑的關鍵步驟是由DAHP(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate，3-脫氧-D-阿拉伯酸-庚酮糖-7-磷酸)合成酶催化反應［15］的，芳香族酸通過變構(gòu)機制對DAHP(的活性或含量)進行反饋抑制調(diào)節(jié)［16］。實驗表明，在潮霉素A生物合成中，基因hyg27編碼一種與DAHP合成酶同源的功能蛋白;基因hyg2編碼的蛋白質(zhì)與4-羥基苯甲酸羥化酶相似，可能催化了3，4-二羥基苯甲酸的合成，目前不能確定羥化反應的底物是4-羥基苯甲酸還是之后的反應中間體;然后，3，4-二羥基苯甲酸(或4-羥基苯甲酸)可能在基因hyg12的蛋白產(chǎn)物的催化下形成一個硫酯類化合物，基因hyg12的蛋白質(zhì)產(chǎn)物與乙酰輔酶A連接酶家族相類似;之后，通過基因hyg9、hyg13(編碼的蛋白產(chǎn)物與?；d體蛋白ACP類似)，基因hyg22(蛋白產(chǎn)物是酰基轉(zhuǎn)移酶AT［17-19］)，基因hyg10(編碼β-酮脂酰合酶KS［20］)以及基因hyg11的協(xié)同作用，得到化合物3-(3，4-二氫苯基)-3-羥基-2-甲基-丙酰ACP。最后，通過基因hyg14和hyg15編碼的功能蛋白3-羥?；鵄CP脫水酶(3-hydroxylacyl ACP dehydratase)和3-酮脂酰ACP還原酶(3-ketoacyl ACP reductase)的催化作用，轉(zhuǎn)變?yōu)?E)-3-(3，4-二羥苯基)-2-甲基丙烯酸ACP。

圖3 潮霉素A在NRRL 2388中可能的生物合成過程Fig.3 Proposed biosynthetic pathway of hygromycin A in Streptomyces hygroscopicus NRRL 2388

潮霉素A結(jié)構(gòu)單元C的合成起始于6-磷酸-葡萄糖。該底物依次經(jīng)過基因hyg18編碼的1-磷酸肌醇合酶和基因hyg25編碼的肌醇單磷酸酶的催化形成肌醇。然后，在基因hyg17編碼產(chǎn)生的肌醇脫氫酶的催化下，肌醇C5位置上發(fā)生氧化反應，再通過hyg8基因編碼的氨基轉(zhuǎn)移酶的作用，形成2L-2-氨基-2-脫氧新肌醇［21］。另外，在潮霉素A的化學結(jié)構(gòu)中有1個在C4和C5之間的亞甲基橋，現(xiàn)在還不確定它形成于哪個階段的，推測有1個甲基在這條合成途徑的倒數(shù)第2個步驟上被轉(zhuǎn)移到了C5上，形成了2L-2-氨基-2-脫氧-5-O-甲基新肌醇，而2L-2-氨基-2-脫氧-4，5-O-亞甲基肌醇的最后形成還需要發(fā)生一個獨特的氧化反應。而這類氧化反應在糖類反應中也是少見的。

3 潮霉素A生物合成基因簇的基因功能驗證及其自抗性機制

目前，一些分子生物學實驗證明了hyg生物合成基因簇的功能，為進一步弄清潮霉素A的生物合成過程提供了很多信息［11，22］。同源重組就是一個研究基因功能的良好方法。

利用同源重組的方法，將兩端與hyg26基因序列同源而中間具有阿普拉霉素抗性標記的DNA片段導入野生型吸水鏈霉菌NRRL 2388中，用以替換hyg26基因，得到SCH30突變株［11］。將野生型和突變型菌株發(fā)酵處理，通過HPLC檢測，可以看到，在野生型中既有潮霉素A又有甲氧潮霉素A;而突變株SCH30中這2種化合物都不存在，但出現(xiàn)了另外3個較高的峰段。經(jīng)分離純化后，3種化合物被證明是潮霉素A類似物:5''-二氫甲氧基-潮霉素A［5''-dihydromethoxy-hygromycin A］、5''-二氫潮霉素A(DHHA)［5''-dihydrohygromycin A］、(E)-3-(3-羥基-4-O-α-巖藻呋喃苯基)-2-甲基丙烯酸［(E)-3-(3-hydroxy-4-O-α-fucofuranosylphenyl-2-methylacrylicacid］。根據(jù)對SCH30發(fā)酵產(chǎn)物的研究，推測:形成5-脫氫-α-L-巖藻呋喃糖模塊的最后一步是由Hyg26催化的α-L-巖藻呋喃糖的氧化過程，但無法確定這步氧化過程發(fā)生于2模塊之間糖苷鍵的形成順序。

任何一種產(chǎn)生抗生素的微生物都會具備一種或幾種自身保護機制，而編碼具有自我保護功能的蛋白質(zhì)的基因一般就存在于抗生素生物合成基因簇內(nèi)部，并作為其中的一部分，與其他基因起協(xié)調(diào)作用［23］。在潮霉素A的生物合成基因簇中，hyg6或hyg29編碼甲基轉(zhuǎn)移酶可能使潮霉素A失活;hyg19和hyg28編碼跨膜運輸?shù)鞍?，可能將潮霉素A轉(zhuǎn)運到膜外而進行保護自身;hyg21編碼磷酸轉(zhuǎn)移酶，使潮霉素A發(fā)生磷酸化而使其失活。體外試驗表明磷酸化的潮霉素A(HA-P)失去了抑菌活性，另外，對hyg21基因雙交突變株進行HPLC分析，結(jié)果表明突變株的發(fā)酵產(chǎn)物中存在潮霉素A，但含量較野生型下降了90%以上，這說明Hyg21對潮霉素A的合成產(chǎn)量有重要影響。但突變株與野生型菌株對潮霉素A有同等的抗性，這說明在吸水鏈霉菌NRRL 2388中存在多種自我保護機制，將潮霉素A磷酸化使其失活只是其中之一。

基因hyg19編碼質(zhì)子梯度依賴型轉(zhuǎn)運蛋白，它能將潮霉素A轉(zhuǎn)運到細胞外，保護菌株不被傷害?；騢yg19的存在對于潮霉素A的合成是必要的。有研究表明敲除基因hyg19會有兩種結(jié)果，其一是突變株中的潮霉素A的產(chǎn)量會減少，并且有DHHA中間體產(chǎn)生。DHHA對大腸埃希菌有微弱的抗菌活性和微弱的體外蛋白合成抑制劑活性。其二是突變株沒有增加對潮霉素A的敏感性，而基因hyg19和hyg21均被敲除的突變株對潮霉素A的敏感性則大大增強。這些資料表明，在合成和轉(zhuǎn)運潮霉素A方面，Hyg21和Hyg19是起協(xié)同作用，同時Hyg19蛋白兼有參與合成潮霉素A和轉(zhuǎn)運潮霉素A的雙重功能［24］。

4 結(jié)語與展望

潮霉素A表現(xiàn)出的廣泛的生物學活性，新穎的結(jié)構(gòu)特征，獨特的作用機制及其潛在的應用價值，顯示出對其進行生物合成過程和合成機制研究的重要意義。組合生物合成是上世紀90年代中后期發(fā)展起來的新技術，隨著后來基因測序技術、基因重組新技術(如PCR-targeting)和異源基因表達技術的發(fā)展，組合生物合成已在生物學領域帶來了革命性的變化，也給化學學科創(chuàng)造新的化學結(jié)構(gòu)和構(gòu)建化合物庫帶來了新的方法［25-27］。利用生物信息學技術，潮霉素A生物合成相關的基因簇已被克隆，并根據(jù)潮霉素A的結(jié)構(gòu)，推測了該抗生素的生物合成途徑。另外，利用同源重組等手段，已得到功能基因的缺失多個突變菌株，并結(jié)合HPLC、LC-MS等技術，已經(jīng)初步確定了部分基因的功能。而隨著對其生物合成各基因功能研究的深入，各基因在其生物合成過程中的作用將會得到進一步的闡明，功能新穎、作用機制獨特的酶將會被發(fā)現(xiàn)并加以利用。

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