蛇黃肝炎湯對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用研究Δ

林 慧，梅全喜，孔祥廉#，王書芹，王云庭（.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院，中山市528400；2.廣東中山市中醫(yī)藥研究所，中山市 528400）

蛇黃肝炎湯為廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院院內(nèi)制劑，臨床應(yīng)用具有清熱解毒、益氣護(hù)肝等功效。本課題組通過前期實(shí)驗(yàn)，觀察到蛇黃肝炎湯在乙型肝炎病毒（HBV）基因轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞系2215細(xì)胞培養(yǎng)中，對2215細(xì)胞分泌表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）具有明顯的抑制作用[1]，但對其肝損傷保護(hù)作用的研究尚屬空白。因此，本研究采用四氯化碳（CCl4）制備小鼠急性肝損傷模型，探討蛇黃肝炎湯對急性肝損傷的保護(hù)作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-754型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；F6/10型超細(xì)勻漿機(jī)（弗魯克（上海）流體機(jī)械制造有限公司）；微量移液器（上海求精生化試劑儀器有限公司）；BS224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；恒溫水浴箱（上海衡平儀器儀表廠）。

1.2 試藥

蛇黃肝炎湯由白花蛇舌草、田基黃、蒲公英、虎杖等9味中藥組成，中藥材購于廣州致信中藥飲片有限公司，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院制劑室鑒定為真品并煎煮；聯(lián)苯雙酯滴丸（廣州星群（藥業(yè)）股份有限公司，批號：IF40003），臨用前以超細(xì)勻漿機(jī)研磨成細(xì)末，加生理鹽水溶解并經(jīng)超聲處理，配制成含藥量為0.2 g·mL-1的溶液，備用；CCl4（分析純，廣州化學(xué)試劑公司）；橄欖油（化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：F20100512）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 動(dòng)物

健康SPF昆明種小鼠，♀♂兼半，體重（20±2）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SYXK（粵）2008-0001）。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物飼養(yǎng)于中山市中醫(yī)院SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按性別分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，環(huán)境溫度為（20±2）℃，相對濕度為70%。

2 方法

2.1 供試液的制備

取蛇黃肝炎湯各味干燥藥材，用10倍體積的蒸餾水浸泡1 h，加熱煮沸2 h，趁熱過濾，藥渣再加8倍體積的蒸餾水加熱煮沸1 h，趁熱過濾，合并2次濾液，濃縮至含生藥量為0.67 g·mL-1的煎液，4℃貯藏，備用，臨用前加蒸餾水稀釋至所需濃度。

2.2 模型復(fù)制、分組和給藥[2，3]

實(shí)驗(yàn)分為6組，即正常對照（等體積生理鹽水）、模型（等體積生理鹽水）、聯(lián)苯雙酯（3 g·kg-1）和蛇黃肝炎湯高、中、低劑量（60、40、20 g·kg-1，相當(dāng)于成人臨床日用量3、2、1倍的劑量）組。ig給藥（0.15 mL·10 g-1），每天1次，連續(xù)7 d。于末次給藥后1 h，除正常對照組外，其余各組均按0.1 mL·10 g-1容積一次性ip 0.1%CCl4，復(fù)制小鼠急性肝損傷模型（CCl4以橄欖油配制成0.1%的溶液）；正常對照組ip等量橄欖油。各組小鼠均禁食不禁水24 h。

2.3 標(biāo)本采集

ip 0.1%CCl424 h后，摘眼球取全血，處死動(dòng)物，摘取肝臟觀察大體外觀后，取同一肝葉用10%中性甲醛溶液固定，其余部分于－20℃貯藏，備用。

2.4 小鼠肝組織10%肝勻漿的制備

準(zhǔn)確稱取0.2 g肝組織塊放入5 mL小燒杯中，加入冰凍生理鹽水為勻漿遞質(zhì)，體積總量為肝組織塊重量的9倍（W∶V＝1∶9），即用移液管量取凍生理鹽水1.8 mL，用滴管取總量2/3的勻漿遞質(zhì)移到小燒杯內(nèi)，小燒杯置冰水中，盡快以眼科剪剪碎肝組織塊，超細(xì)勻漿機(jī)以10 000 r·min-1將其研磨成10%組織勻漿，勻漿時(shí)間10 s/次，間隙30 s，連續(xù)3次，使組織勻漿化（操作均在冰水中進(jìn)行）。用剩余的1/3勻漿遞質(zhì)沖洗勻漿器，并合并倒入試管中，4℃下4 000 r·min-1離心15 min，輕輕吸取適量上清液進(jìn)行SOD活性、MDA含量測定。

2.5 血清ALT、AST活性的測定（賴氏法）

摘眼球取血后，將血液放置約1 h，3 000 r·min-1離心15 min，輕輕吸取上清液，按試劑盒說明書以比色法測定并計(jì)算出相應(yīng)ALT和AST的酶活力單位值。

2.6 肝組織勻漿MDA含量的檢測（TBA法）

按試劑盒說明書步驟，將樣品和各種試劑依次加入試管，用保鮮膜封閉管口后刺一小孔，95℃水浴40 min，取出后流水冷卻，4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，532 nm波長、1 cm光徑、蒸餾水調(diào)零，比色法測各管吸光度值，計(jì)算MDA含量。肝組織勻漿的蛋白含量測定采用雙縮脲法。

2.7 肝組織勻漿SOD活性的檢測

按試劑盒說明書步驟，取上述制備好的10%肝組織勻漿上清液，用生理鹽水按1∶9稀釋成1%組織勻漿液，將樣品和各種試劑依次加入試管，37℃水浴40 min，取出后加顯色劑，室溫放置10 min，550 nm波長、1 cm光徑、蒸餾水調(diào)零，比色法測各管吸光度值，根據(jù)計(jì)算公式求出各樣本中的SOD活性。

2.8 一般情況觀察

各組小鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)、飲食、皮毛、體重。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s 表示，用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料組間比較用One-WayANOVA方差分析。

3 結(jié)果

3.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)期間正常對照組小鼠精神充沛，肢體靈活，飲食正常，皮毛整潔，無死亡；模型組小鼠精神萎靡，活動(dòng)遲鈍，飲食減少，皮毛凌亂；蛇黃肝炎湯高、中劑量組小鼠的精神、飲食等整體情況明顯優(yōu)于模型組和蛇黃肝炎湯低劑量組，但較正常對照組稍差。

3.2 蛇黃肝炎湯對模型小鼠血清ALT、AST活性的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST活性顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，蛇黃肝炎湯高、中劑量組小鼠血清中的ALT、AST活性均顯著降低（P＜0.05），提示蛇黃肝炎湯對急性肝損傷小鼠有一定的保護(hù)作用，且呈一定的劑量依賴關(guān)系。蛇黃肝炎湯對模型小鼠血清ALT、AST活性的影響見表1。

3.3 蛇黃肝炎湯對模型小鼠肝組織SOD活性、MDA含量的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織MDA含量顯著升高，同時(shí)SOD活性顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，蛇黃肝炎湯高、中劑量組小鼠肝組織MDA含量顯著下降，SOD活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05），提示蛇黃肝炎湯有一定的抗脂質(zhì)氧化作用且其作用呈一定的劑量依賴關(guān)系。蛇黃肝炎湯對模型小鼠肝組織SOD活性、MDA含量的影響見表2。

表1 蛇黃肝炎湯對模型小鼠血清ALT、AST活性的影響（±s，n＝12）Tab 1 Effect of Shehuang ganyan decoction on the activities ofALT andAST in model mic（e±s，n＝12）

表1 蛇黃肝炎湯對模型小鼠血清ALT、AST活性的影響（±s，n＝12）Tab 1 Effect of Shehuang ganyan decoction on the activities ofALT andAST in model mic（e±s，n＝12）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別正常對照組模型組蛇黃肝炎湯高劑量組蛇黃肝炎湯中劑量組蛇黃肝炎湯低劑量組聯(lián)苯雙酯組ALT/U·L-1 49.52±10.23 159.55±49.55＊85.23±25.81#79.21±18.79#147.59±48.36 95.23±75.23#AST/U·L-1 76.38±11.89 201.45±83.94＊128.65±58.23#145.78±65.69#198.87±65.74 112.24±62.56#

表2 蛇黃肝炎湯對模型小鼠肝組織SOD活性、MDA含量的影響（±s，n＝12）Tab 2 Effect of Shehuang ganyan decoction on the activities of SOD and MDAcontent in model mic（e±s，n＝12）

表2 蛇黃肝炎湯對模型小鼠肝組織SOD活性、MDA含量的影響（±s，n＝12）Tab 2 Effect of Shehuang ganyan decoction on the activities of SOD and MDAcontent in model mic（e±s，n＝12）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

MDA/U·mg-1 8.33±4.36 25.78±9.59＊17.56±8.12#15.47±7.25#23.51±8.93 16.72±7.64#組別正常對照組模型組蛇黃肝炎湯高劑量組蛇黃肝炎湯中劑量組蛇黃肝炎湯低劑量組聯(lián)苯雙酯組SOD/U·mg-1 65.32±7.89 32.58±8.45＊42.87±10.41#41.58±10.76#31.11±8.53 43.14±12.23#

3.4 蛇黃肝炎湯對模型肝損傷小鼠肝臟形態(tài)學(xué)的影響

正常對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞排列規(guī)則，肝索及肝竇延中央靜脈呈放射狀排列，肝細(xì)胞未見明顯異常，未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組肝臟中央靜脈和匯管區(qū)靜脈周圍可見淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和多少不等噬酸性粒細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)周圍肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)可見紅染顆粒，呈氣球樣變，部分細(xì)胞核碎裂、溶解，提示嚴(yán)重的肝臟炎癥反應(yīng)；蛇黃肝炎湯低劑量組肝臟中央靜脈和匯管區(qū)靜脈周圍均可見淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和少量噬酸性粒細(xì)胞浸潤，靜脈周圍少許肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)可見紅染顆粒，呈氣球樣變，炎細(xì)胞浸潤；蛇黃肝炎湯高、中劑量組肝臟病變均明顯減輕，肝小葉結(jié)構(gòu)較為清晰，大部分肝索排列整齊，少許肝細(xì)胞腫脹，且蛇黃肝炎湯高劑量組部分小鼠肝臟極個(gè)別肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見紅染顆粒，肝細(xì)胞水腫程度比蛇黃肝炎湯中劑量組稍輕，炎細(xì)胞浸潤不明顯，提示其對肝臟的保護(hù)作用更加顯著。小鼠肝臟病理組織形態(tài)學(xué)見圖1。

4 討論

CCl4肝損傷動(dòng)物模型是一種比較經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型，而肝損傷是多種致病因素造成的肝臟病理過程的一部分，是肝纖維化和肝硬化的起始動(dòng)因。我國衛(wèi)生部頒布的《中藥藥理肝損實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)原則》中明確制定應(yīng)用CCl4肝損傷動(dòng)物模型進(jìn)行保肝降酶新藥的藥理實(shí)驗(yàn)，同時(shí)該模型亦被廣泛用于肝細(xì)胞保護(hù)藥物和保健食品的研究中[4，5]。本研究采用廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山中醫(yī)院自行研制的蛇黃肝炎湯，對CCl4致肝損傷小鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性治療。方中白花蛇舌草具清熱解毒、消癰利尿之功，以其為主藥的蛇黃肝炎湯對大鼠CCl4所致肝炎有保護(hù)作用；田基黃對CCl4所致小鼠肝組織及原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞損傷有保護(hù)作用[6]；蒲公英能顯著緩解CCl4肝損傷引起的組織學(xué)改變，有保肝利膽作用；虎杖有效成分藜蘆酚可體外抑制肝微粒體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而具護(hù)肝作用[7]。

圖1 小鼠肝臟病理組織形態(tài)學(xué)（200×）A.正常對照組；B.模型組；C.蛇黃肝炎湯高劑量組；D.蛇黃肝炎湯中劑量組；E.蛇黃肝炎湯低劑量組；F.聯(lián)苯雙酯組Fig 1 histopathological morphology of mice’s liver（200×）A.normal control group；B.model group；C.Shehuang ganyan decoction high-dose group；D.Shehuang ganyan decoction medium-dose group；E.Shehuang ganyan decoction low-dose group；F.bifendate group

本研究表明，模型組較正常對照組血清ALT、AST活性顯著升高，結(jié)合病理組織學(xué)檢查，表明CCl4所致小鼠急性肝損傷模型復(fù)制成功。高、中劑量蛇黃肝炎湯均能顯著降低由CCl4所致小鼠血清ALT、AST活性的升高，其降低作用與目前公認(rèn)的降氨基酸轉(zhuǎn)移酶藥聯(lián)苯雙酯較為接近。高、中劑量蛇黃肝炎湯能顯著降低模型小鼠肝組織勻漿液中的MDA含量，并顯著升高SOD活性。肝病理切片顯示，各劑量蛇黃肝炎湯組均較模型組病理損傷減輕，量效關(guān)系明顯，且蛇黃肝炎湯高、中劑量組的肝保護(hù)作用優(yōu)于聯(lián)苯雙酯組，表明蛇黃肝炎湯具有增強(qiáng)肝臟抗氧化能力、減輕脂質(zhì)過氧化物生成和保護(hù)肝臟的作用。

綜上所述，蛇黃肝炎湯對CCl4所致小鼠急性肝損傷有一定的保護(hù)作用，且其保護(hù)作用可能與抑制自由基的產(chǎn)生、減少脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

[1] 孔祥廉，林 慧，梅全喜，等.蛇黃肝炎合劑對2215細(xì)胞分泌HBsAg及HBeAg的抑制作用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（8）：1 703.

[2] 李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：158.

[3] 王福根，孫靜霞.肝損傷動(dòng)物模型的建立和應(yīng)用[J].中國藥房，2006，17（9）：702.

[4] 中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范[S].北京：清華同方出版社，2003：133.

[5] 江泉觀，紀(jì)云晶，常云勛.環(huán)境化學(xué)毒物防治手冊[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：515.

[6] 梅全喜.廣東地產(chǎn)藥材研究[M].廣州：廣東科技出版社，2011：281、257．

[7] 梅全喜.現(xiàn)代中藥藥理與臨床應(yīng)用手冊[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2008：175、597.