天麻與鉤藤配伍前后天麻素在SHR大鼠肝臟和腎臟的分布與歸經(jīng)探討Δ

李 瑩，李曉倩，王 興，辛 秀，張衛(wèi)國，王敏智（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都市 610031）

天麻是蘭科植物天麻Gastrodia elata BL.的干燥塊莖，性甘、味平，歸肝經(jīng)，為治療肝陽上亢、肝風(fēng)內(nèi)動的要藥。天麻中含有天麻素、異天麻素、香莢蘭醇、香莢蘭醛、天麻多糖等成分[1]。本研究通過測定天麻與鉤藤配伍前后效應(yīng)成分天麻素（Gastrodin）在SHR大鼠肝臟、腎臟的分布，討論藥對配伍作用對天麻素在大鼠體內(nèi)分布過程的影響，初步探討天麻的歸經(jīng)理論和藥對配伍在歸經(jīng)中的意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津儀器有限公司）；TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器責(zé)任有限公司）；MTN-2800W型氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

天麻、鉤藤購自四川新荷花飲片公司，經(jīng)西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院宋良科副教授鑒定為真品；天麻素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110807-200205）；間苯三酚（北京化學(xué)試劑公司，批號：040401）；甲醇、乙腈（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純）；其余試劑為分析純。

1.3 動物

14周齡SHR大鼠65只，♂，體重（270±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2008-0005）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenence Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-1%磷酸（3∶97）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥后的天麻素對照品適量，加甲醇溶解并稀釋成濃度為0.2 g·mL-1的天麻素對照品貯備溶液，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱取減壓干燥后的內(nèi)標(biāo)間苯三酚適量，加甲醇溶解并稀釋成濃度為0.4 g·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，備用。

2.3 分組與給藥

將65只SHR大鼠按體重隨機(jī)分為3組，即對照（等容生理鹽水）、天麻（0.95 g·kg-1）、天麻鉤藤（2.2 g·kg-1）組。其中對照組5只，天麻組和天麻鉤藤組分別按時間點細(xì)分為6個時間組，即15、30、60、120、180、240 min組，每組5只。制備0.1 g·mL-1的天麻混懸液、0.2 g·mL-1（天麻∶鉤藤＝3∶4）的共煎液。按照陳奇主編的《中藥藥理學(xué)方法》中的給藥量ig給藥。大鼠日給藥劑量＝人日給藥劑量×6.17×校正系數(shù)。其中，校正系數(shù)為大鼠實際體重與大鼠標(biāo)準(zhǔn)體重的比值。

2.4 樣品預(yù)處理

稱取大鼠肝臟與腎臟組織，置于勻漿器中，加入2.5倍生理鹽水，勻漿，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液。精密吸取250 μL勻漿液，加8倍量甲醇和50 μL內(nèi)標(biāo)間苯三酚，渦旋混勻30 s，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液，60 ℃水浴下氮吹干，100 μL 雙蒸水復(fù)溶，靜置 12 h，渦旋，10 000 r·min-1離心 10 min，取上清液，即得[2，3]。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

在8支塑料離心試管中，分別精密加入250 μL肝臟組織空白勻漿，再各加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)工作液配制成天麻素系列濃度分別為 200、50、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μg·mL-1的樣品。按“2.4”項下方法預(yù)處理樣品，分別吸取10 μL進(jìn)樣。以樣品濃度（X）為橫坐標(biāo)，樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得天麻素在肝臟中的回歸方程為Y＝0.008 2X－0.000 7（r＝0.999 5）；天麻素在腎臟中的回歸方程為Y＝0.010 9X－0.001 6（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，天麻素的檢測濃度在0.312 5～200 μg·mL-1范圍內(nèi)同其峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比線性關(guān)系良好。

2.6 精密度與回收率試驗

精密吸取250 μL大鼠肝臟、腎臟空白組織勻漿置于塑料離心管中，分別加入天麻素對照品貯備液適量，制成低、中、高濃度的樣品液，肝臟為0.625、5、50 μg·mL-1，腎臟為0.625、5、40 μg·mL-1，按“2.4”項下方法預(yù)處理樣品，并按“2.1”項下色譜條件測定，計算得濃度A。上述處理得到的樣品分別在24 h內(nèi)每隔6 h測定1次，求算日內(nèi)精密度；并在連續(xù)4 d內(nèi)每天測定1次，求算日間精密度。精密度試驗結(jié)果見表1、表2。

精密吸取250 μL流動相，加入天麻素對照品貯備液適量，配制上述低、中、高濃度樣品液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算得濃度B。濃度B與加入量真實值之比為方法回收率；濃度A與濃度B之比為提取回收率?；厥章试囼灲Y(jié)果見表1、表2。

表1 肝臟樣品的回收率和精密度試驗結(jié)果Tab 1 Precision and recovery of liver tissue

表2 腎臟樣品的回收率和精密度試驗結(jié)果Tab 2 Precision and recovery of kidney tissue

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密配制天麻素低、中、高濃度的肝勻漿（0.625、5、50 μg·mL-1）和腎勻漿（0.625、5、40 μg·mL-1）樣品，置于－20 ℃冰箱30 d后，按“2.4”項下方法預(yù)處理，測得天麻素含量的RSD均＜5.7%；配制同樣樣品，置于－20℃冰箱保存24 h后室溫解凍1 h，取出少量測定天麻素含量，其余繼續(xù)－20℃冰箱保存24 h，反復(fù)凍融3次，測得天麻素含量的RSD均＜10%?？梢姡炻樗卦诟?、腎組織樣品中有良好穩(wěn)定性。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一份組織勻漿樣品重復(fù)進(jìn)樣6次，測定天麻素含量，得RSD＝1.4%，表明該方法有良好重復(fù)性。

2.9 組織分布實驗

將分組的SHR大鼠分別在末次給藥的15、30、60、120、180、240 min，經(jīng)股動脈及斷頭放血后，取出肝臟和腎臟制備勻漿液樣品并進(jìn)樣測定。各時間點組織中的天麻素含量見表3。

表3 各時間點組織中的天麻素含量（mg·g-1）Tab 3 Content of gastrodin in tissue for each time point（mg·g-1）

配伍前后肝臟、腎臟的2組數(shù)據(jù)分別用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗，討論是否有顯著性差異。配伍前后顯著性差異分析見表4。

表4 配伍前后顯著性差異分析Tab 4 Analysis of significant difference before and after compatibility of G.elata and Uncariae Ramulus Cum Uncis Uncariae

由表4可見，肝臟、腎臟中配伍前后2組數(shù)據(jù)用t檢驗分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

研究結(jié)果表明，SHR大鼠ig天麻混懸液后，效應(yīng)成分天麻素在腎臟內(nèi)的最高血藥濃度（Cmax）高于肝臟。這與文獻(xiàn)[4]報道中使用放射自顯影方法所測定的結(jié)果基本一致。但是在給予天麻鉤藤水煎液后，效應(yīng)成分的組織分布情況卻出現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)。這說明并不能單純地以使用單味藥物時某些時間點中藥有效成分在體內(nèi)的選擇性分布來論證中藥的歸經(jīng)理論，還需從其與藥物的配伍使用等方面來綜合考慮。

根據(jù)數(shù)據(jù)顯示，天麻與鉤藤配伍后，天麻素在肝臟中Cmax增大，分布速率加快，消除速率加快；在腎臟中Cmax減小，消除速率減慢。綜上結(jié)果，推論鉤藤對天麻歸肝經(jīng)可能有協(xié)同增強(qiáng)作用。這與天麻鉤藤飲方解中的天麻、鉤藤共為君藥，配伍使用以達(dá)平肝熄風(fēng)之療效[5]相一致。

研究數(shù)據(jù)顯示，SHR大鼠ig天麻混懸液后，天麻素在肝臟的分布出現(xiàn)雙峰，而在腎臟中并未出現(xiàn)此情況。據(jù)文獻(xiàn)報道，某些采用正常大鼠血漿為對象進(jìn)行的天麻素藥動學(xué)研究中血漿濃度也出現(xiàn)了二次達(dá)峰的現(xiàn)象[4]，據(jù)此推斷天麻素在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程可能存在“肝腸循環(huán)”的情況，本研究中肝臟二次達(dá)峰的現(xiàn)象可能與之有關(guān)。但是在已有的文獻(xiàn)報道中，天麻素是否在大鼠體內(nèi)存在肝腸循環(huán)還存在爭議，故此具體的原因還需進(jìn)一步進(jìn)行論證。

數(shù)據(jù)顯示，SHR大鼠ig天麻混懸液后，肝臟在180 min出現(xiàn)二次達(dá)峰，而天麻與鉤藤配伍后雙峰現(xiàn)象消失。這是否說明天麻與鉤藤的配伍使用影響了天麻素的肝腸循環(huán)還有待于進(jìn)一步的研究論證。

由本研究可知，天麻與鉤藤的配伍使用對天麻中的效應(yīng)成分天麻素在SHR大鼠體內(nèi)的分布有較大影響，明顯改變了天麻素的藥動學(xué)過程。但是，產(chǎn)生這種影響的原因是否由于天麻、鉤藤的配伍對天麻歸肝經(jīng)有協(xié)同加強(qiáng)的作用，還有待于通過其他大量的研究證實。

[1] 康延國.中藥鑒定學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2005：237.

[2] 王 興，胡瑞娟，黃 熙，等.RP-HPLC測定大鼠服用大川芎丸提取物后血漿中的天麻素[J].華西藥學(xué)雜志，2003，18（5）：341.

[3] 程 剛，郝秀華，劉國良，等.天麻素在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究[J].中國藥學(xué)雜志，2003，38（2）：128.

[4] 陸光偉，鄒元杰，莫啟忠.3H-天麻素在大鼠體內(nèi)的吸收分布、代謝和排泄[J].藥學(xué)學(xué)報，1985，20（3）：167.

[5] 段富津.方劑學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005：225.