豬2型圓環(huán)病毒石河子流行株全基因組的克隆和序列分析

張?jiān)俪瑔誊?，蔡擴(kuò)軍，陳創(chuàng)夫，孟慶玲，李劼

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003）

豬2型圓環(huán)病毒石河子流行株全基因組的克隆和序列分析

張?jiān)俪?，喬軍，蔡擴(kuò)軍，陳創(chuàng)夫，孟慶玲，李劼

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003）

根據(jù)已發(fā)表的豬2型圓環(huán)病毒（Porcine circovirus type 2，PCV－2）全基因組序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，用PCR的方法分2段克隆圓環(huán)病毒的基因，測序后拼接得到該圓環(huán)病毒的基因組。序列分析結(jié)果表明，PCV－SHZ基因組全長為1767bp（Genbank登錄號(hào)：JF718784），基因型為PCV－2a。用DNAMAN軟件將此株病毒基因組與國內(nèi)其它12個(gè)省市PCV－2參考株的基因組核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，同源率為95.25%～99.55%。用MEGA軟件分別對(duì)該病毒和參考株的全基因組、ORF1和ORF2進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明PCV－2流行株在進(jìn)化上存在地域上的相關(guān)性。

豬2型圓環(huán)病毒；基因組；序列分析

豬2型圓環(huán)病毒（Porcine circovirus type 2，PCV－2）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種 DNA 病毒［1］，能引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬呼吸疾病綜合征、豬皮膚和腎病綜合征等多種疾病［2］，總稱為豬圓環(huán)病毒?。≒orcine circovirus diseases，PCVDs）。PCV－2在淋巴系統(tǒng)中增殖，可引起豬的免疫抑制，從而使機(jī)體更易感染其他病原，這是圓環(huán)病毒與豬的許多疾病混合感染的重要原因［3］。PCV－2既可垂直傳播，又可水平傳播，具有較強(qiáng)的易感性［4］。該病自1998年被發(fā)現(xiàn)以來，給世界各國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［5］。

近年來，隨著石河子墾區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，許多大型養(yǎng)豬場從國外或內(nèi)地引入大量的種豬。然而，伴隨在引種的同時(shí)，一些新的豬病也帶入我區(qū)，給我區(qū)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的威脅。近3年，石河子墾區(qū)養(yǎng)豬場每年疑似豬圓環(huán)病毒病的病例不斷增加，該病的危害日趨嚴(yán)重。

為了了解石河子墾區(qū)豬圓環(huán)病毒流行株的遺傳與變異情況，本研究對(duì)豬2型圓環(huán)病毒石河子流行株（PCV－SHZ）全基因組進(jìn)行了克隆、測序和遺傳進(jìn)化分析，旨在為該病積累了流行病學(xué)資料，而且也為我區(qū)該病的科學(xué)防控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

豬2型圓環(huán)病毒石河子流行株（PCV－SHZ株）分離自新疆石河子地區(qū)某養(yǎng)豬場送檢的豬圓環(huán)病毒病疑似病豬。

主要試劑有：Taq plus DNA聚合酶、dNTPs、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自上海生物工程公司。PMD18－T載體購自大連TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 PCV－SHZ株DNA的提取

PCV－SHZ流行株分離自新疆石河子地區(qū)某養(yǎng)豬場送檢的豬圓環(huán)病毒病疑似病豬。取病毒培養(yǎng)液200μL，加入等量的Trizol進(jìn)行裂解，然后倒入1.5 mL的EP管中，再加入等量的酚氯仿抽提2次，12000r／m離心5min；取上清，然后加入2倍體積的冰凍乙醇，于4℃、12000r／m離心20min；倒掉乙醇，于干燥通風(fēng)處晾干，加入80μL的滅菌蒸餾水溶解管底部的DNA即可。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)從Genbank下載PCV－2基因組序列，根據(jù)引物設(shè)計(jì)的一般原則設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物。

PCV－N1：5′－ACCAGCGCACTTCGGCAGCG－3′；

PCV－N2：5′－TCATATGGAAATTCAGGGCA －3′；

PCV－N3：5′－TTACCAGCAATCAGACCCCG －3′；

PCV－N4：5′－AATACTTACAGCGCACTTCT－3′。

PCV－N1和PCV－N2進(jìn)行PCR得到的產(chǎn)物長

度為982bp，PCV－N3和PCV－N4得到的產(chǎn)物長度為961bp。2對(duì)引物擴(kuò)增的長度覆蓋PCV－2全基因組。

1.2.3 PCR反應(yīng)

取提取的DNA為模板4μL，10×PCR buffer 5 μL、引 物 PCV－N1（25pmol／μL）、PCV－N2（25 pmol／μL）各 1μL，2.5mmol／L dNTPs 4μL，水34.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL（5U／μL）混勻。PCR采用50μL的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：96℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，51℃退火40s，72℃延伸1min 30s，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

PCV－N3和PCV－N4的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系同上。

1.2.4 DNA瓊脂糖凝膠電泳及回收

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中，以0.5×TAE緩沖液，100V電壓電泳30min，溴化乙錠染色。

電泳結(jié)束后，在紫外線下觀察，記錄結(jié)果并拍照保存。

采用上海生工生產(chǎn)的DNA gel Extraction Kit回收擴(kuò)增出來的DNA片段。

1.2.5 PCV－SHZ株擴(kuò)增片段的克隆

將回收的2個(gè)片段分別和載體pMD18－T連接，次日轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在氨芐平板上篩選，再用菌液PCR進(jìn)一步篩選驗(yàn)證，命名為PTPCV－SHZ1和PTPCV－SHZ2。

1.2.6 測序結(jié)果與分析

將鑒定正確的重組載體PTPCV－SHZ1和PTPCV－SHZ2送上海生工生物工程有限公司測序；用DNAMAN軟件將測序的2個(gè)片段拼接得到該病毒的全基因組PCV－SHZ，然后與我國其他省市的12個(gè)參考株進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分析。

用MEGA軟件進(jìn)行全基因組、ORF1和ORF2的進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV－SHZ株基因組的PCR擴(kuò)增與克隆

用特異性引物PCV－N1和PCV－N2對(duì)基因組的前半段基因進(jìn)行擴(kuò)增，在1.5%瓊脂糖凝膠中得到了大小與預(yù)期值982bp相符的目的條帶（圖1）。用特異性引物PCV－N3和PCV－N4對(duì)基因組的后半段基因進(jìn)行擴(kuò)增，在1.5%瓊脂糖凝膠中得到了大小與預(yù)期值961bp相符的目的條帶（圖1）。克隆到PMD18－T載體上，轉(zhuǎn)化后到DH5α細(xì)胞中，涂板，挑取單菌落，做菌液PCR篩選，成功篩選到了陽性轉(zhuǎn)化子（圖2）。

圖1 目的基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1PCR amplification of target gene fragments

圖2 陽性重組菌液的PCR鑒定結(jié)果Fig.2PCR identification of positive recombinant bacteria.

2.2 PCV－SHZ株基因組苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列的分析

將得到的2個(gè)片段用DNAMAN軟件拼接得到該豬2型圓環(huán)病毒PCV－SHZ株全長基因組（序列已提交Genbank，登陸號(hào)：JF718784）。該序列長1767 bp，含有ORF1和ORF2兩個(gè)開放閱讀框，其中ORF1長度為945個(gè)堿基，編碼313個(gè)氨基酸；ORF2長度為705個(gè)堿基，編碼233個(gè)氨基酸。根據(jù)ORF2中存在的特異性核苷酸序列，確定PCV－SHZ株的基因型為PCV－2a。將PCV－SHZ株與國內(nèi)其它12個(gè)省的參考株進(jìn)行同源性比較，其全基因組的核苷酸同源率為95.25%～99.55%；ORF1的核苷酸同源率為96.30%～99.68%，氨基酸同源率為97.77%～99.68；ORF2的核苷酸同源率為91.19%～99.29%，氨基酸同源率為86.38%～98.71%（表1）。

2.3 PCV－SHZ系統(tǒng)進(jìn)化分析

用MEGA軟件將PCV－SHZ株與國內(nèi)其它12個(gè)省的參考株分別對(duì)全基因組、ORF1和ORF2進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖3a、b、c），3個(gè)進(jìn)化樹結(jié)果均表明：PCV－SHZ株與河南參考株的關(guān)系最近，其次是甘肅和黑龍江的參考株。圖3中各省份參考株的Genbank登錄號(hào)同表1。

表1 PCV－SHZ株與國內(nèi)其它12個(gè)省的參考株同源性比較結(jié)果 %Tab.1Homology comparison with reference strains of PCV－SHZ in 12provinces in China

圖3 基于PCV－2ORF1、ORF2和全基因組的遺傳進(jìn)化樹Fig.3Phylogenetic tree based on ORF1，ORF2and genome of PCV－2

3 討論

PCV是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病毒［6］。目前已知的PCV有2個(gè)血清型，即PCV－1和PCV－2［7］。PCV1 沒 有 致 病 性，PCV－2 具 有 致 病 性［8］。PCV－2基因組全長為1767bp或1768bp，可能含有11個(gè)編碼產(chǎn)物在2～36kDa的開放讀碼框，其中最主要的是 ORF1和 ORF2［9］。ORF1（51～995bp）編碼病毒的復(fù)制蛋白，變異較??；而ORF2（1033～1734bp）編碼病毒的衣殼蛋白，變異較大［10］。在ORF2中存在可區(qū)分兩型的特異性核苷酸序列，PCV－2b（PCV－2－1 型）為1486－TcA／aac／CCC／GG，PCV－2a（PCV－2－2型）為 AcC／aac／AAA／AT［11］。

ORF1和ORF2是PCV－2最主要的2個(gè)開放性閱讀框［9］。本實(shí)驗(yàn)將PCV－SHZ株分別與全國12個(gè)省份的參考株對(duì)其基因組核苷酸序列、ORF1和ORF2的核苷酸序列與氨基酸序列進(jìn)行了同源性比較，結(jié)果顯示PCV－SHZ株與河南參考株的同源率最高，全基因組的核苷酸同源率為99.55%，ORF1核苷酸和氨基酸同源率分別為99.68%和99.68%，ORF2的核苷酸和氨基酸同源率分別為99.29%和98.71%。ORF1和ORF2的核苷酸序列與氨基酸序列同源性比較結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，ORF1的同源率比較高，變異比較小，相對(duì)保守；ORF2的同源率比較低，變異比較大。

現(xiàn)有的研究表明，我國現(xiàn)在的流行株主要是以PCV－2b為主［12］。然而，本實(shí)驗(yàn)中對(duì) PCV－SHZ 測序結(jié)果顯示，該毒株基因組全長為1767bp，基因型為PCV－2a。翟少倫等2010年也在新疆檢測到了1株基因型為PCV－2a的野毒株［13］。據(jù)此，我們推測新疆地區(qū)豬2型圓環(huán)病毒的流行株情況可能與全國流行情況存在差異，可能主要是以PCV－2a為主。在本實(shí)驗(yàn)中，分別從ORF1、ORF2和全基因組的角度對(duì)PCV－SHZ株和全國其它12個(gè)省的參考株共13株毒株進(jìn)行了進(jìn)化樹分析，3個(gè)進(jìn)化樹均顯示：PCV－SHZ株與河南的參考株關(guān)系最近，其次為甘肅和黑龍江的參考株。綜合3個(gè)進(jìn)化樹分析，親緣關(guān)系較近的參考株之間一般所屬的省份在地理位置上也比較相近，尤其是北方省份和南方省份之間的親緣關(guān)系差異更明顯，如新疆、河南、甘肅、黑龍江四個(gè)北方省份的參考株在ORF2和全基因組的系統(tǒng)進(jìn)化樹上均自成一支，而其它南方省份的參考株則另成一支。系統(tǒng)進(jìn)化研究表明，PCV－2的流行分布和進(jìn)化具有一定的地域性。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)PCV－SHZ株的測序和序列分析，對(duì)其基因型和序列特征進(jìn)行了研究，為研究新疆PCV－2的分子流行病學(xué)提供了一定的基礎(chǔ)。通過對(duì)PCV－SHZ株和國內(nèi)其它12個(gè)省份的參考株進(jìn)行進(jìn)化樹分析，為研究新疆與國內(nèi)其它省份豬2型圓環(huán)病毒的親緣關(guān)系以及我國豬2型圓環(huán)病毒的流行特點(diǎn)和進(jìn)化趨勢積累了流行病學(xué)資料。

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Cloning and Complete Genome Analysis of Shihezi Strain of Porcine Circovirus Type 2

ZHANG Zaichao，QIAO Jun，CAI Kuojun，CHEN Chuangfu，MENG Qingling，LI Jie
（Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine，Department of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

According to the published genome sequences of PCV－2，two pairs of specific primer were designed to amplify the full genome of Porcine circovirus type 2 （PCV－2）.Two fragments were amplified and sequenced respectively，and then they were linked together to gain the full length sequence of PCV－2genome.The results of sequence analysis showed that the complete genome of PCV－SHZ strain was 1767bp and its genetype belonged to PCV－2a.Compared with the genome sequence of other 12 reference isolates from China，the identities range from 95.25%to 99.55%.Phylogenetic trees based on the full genome，ORF1 and ORF2by MEGA software showed that there existed a areal association in evolution of PCV－2isolates.

Porcine circovirus type 2；genome；sequence analysis

S858.28；Q781

A

1007－7383（2011）06－0696－04

2011－09－08

農(nóng)業(yè)部重大轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)（2009ZX08006－003B）

張?jiān)俪?987－），男，碩士生，專業(yè)方向?yàn)椴≡肿由飳W(xué)；e－mail：zhangzaichao＠sina.cn。

喬軍（1971－），男，教授，從事分子病毒學(xué)研究；e－mail：qj710625＠yahoo.com.cn。