載緩釋阿米卡星導(dǎo)尿管的研制及體外釋放試驗(yàn)的研究

熊明峰，費(fèi) 軍，劉宏亮，余洪俊

導(dǎo)尿管留置體內(nèi)所發(fā)生的導(dǎo)尿管相關(guān)性尿路感染(catherter-associated urinary tract infection，CAUTI)是常見的醫(yī)院感染，在我國醫(yī)院感染中的比例為20．8% ～31．7%，僅次于呼吸道感染［1］。而在美國為42%，日本則高達(dá)77%，均居醫(yī)院感染的首位［2］。CAUTI的發(fā)生率隨導(dǎo)尿管保留日數(shù)增加而呈直線上升，開放式尿道引流留置＞5天，無癥狀菌尿發(fā)生率為100%［3］。在保留導(dǎo)尿的病人中，30%出現(xiàn)有癥狀的尿道感染，100%出現(xiàn)無癥狀的菌尿［4］。尿路感染易并發(fā)腎盂腎炎、膀胱炎、感染性結(jié)石及繼發(fā)性菌血癥，造成患者住院天數(shù)延長及醫(yī)療費(fèi)用增加。文獻(xiàn)資料提示導(dǎo)尿病人菌血癥的發(fā)生率是非導(dǎo)尿病人的5～8倍，由尿路感染引起菌血癥及膿毒癥占2% ～4%，其病死率為13% ～30%［5］。如何降低CAUTI是目前國內(nèi)外臨床研究的熱點(diǎn)問題。

尿路感染絕大多數(shù)致病菌為革蘭陰性腸道桿菌，常見的有大腸埃希菌、克雷伯氏菌、變形桿菌、假單胞菌、腸桿菌、沙雷菌及念珠菌等［6］。留置導(dǎo)尿的感染菌和一般尿路感染的致病菌種類相同。衛(wèi)生部全國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)(MOH National Antimicrobial Resistant InvestigationNet，Mohnarin)從男、女性尿標(biāo)本中分離的菌株進(jìn)行分析，其致病菌依然是以大腸埃希菌為代表的革蘭陰性桿菌為主，但腸球菌等革蘭陽性菌所占比例有所增多;致病菌對(duì)喹諾酮類、第3代頭孢菌素的耐藥率進(jìn)一步升高，甚至達(dá)到了74．8%［7］。對(duì)耐藥的細(xì)菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌常同時(shí)攜帶多種耐藥酶基因［8］，其中β-內(nèi)酰胺酶、碳青霉烯酶仍是主要的耐藥機(jī)制［9］。阿米卡星對(duì)革蘭陰性桿菌仍保持較高的敏感率，對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌亦如此，敏感率約為83．3%［10］。

90年代初，專家們開始研究使用各種涂層導(dǎo)尿管，利用導(dǎo)尿管表面涂布材料的作用來減少相關(guān)感染。據(jù)報(bào)道，管外涂上水楊酸可抑制＞95%的革蘭陽性桿菌，可防止細(xì)菌和酵母菌黏附在硅膠導(dǎo)尿管上，達(dá)到預(yù)防感染的目的［11］。另外，導(dǎo)尿管漆包一層銀合金，可利用銀所具有的廣譜抑菌作用，減少菌尿發(fā)生［12］，尤其是對(duì)于短期使用導(dǎo)尿管的女性患者效果最好。但由于銀合金導(dǎo)尿管的價(jià)錢較高，在臨床使用受到了限制。基于這些研究基礎(chǔ)，我們選擇了價(jià)格低廉且耐藥率相對(duì)較低的阿米卡星，制作負(fù)載有阿米卡星涂層的抗菌導(dǎo)尿管，希望在降低成本的同時(shí)，對(duì)CAUTI的防治也能發(fā)揮積極的作用。

材料與方法

1 儀器與試劑 (表1、2)

表1 試劑

表2 儀器

2 模型制備

2．1 普通導(dǎo)尿管處理 取20mm硅膠導(dǎo)尿管，在超聲波清洗器中用75%乙醇溶液振蕩清洗，去除導(dǎo)尿管表面雜質(zhì)。干燥后在2%的戊二醛交聯(lián)劑處理溶液中浸泡12小時(shí)，然后用去離子水沖洗去除多余的戊二醛。

2．2 復(fù)方殼聚糖導(dǎo)尿管制作 取2%乙酸溶液40ml，在50℃磁力攪拌下，緩慢加入0．5g殼聚糖，攪拌至溶液中無氣泡;緩慢滴加0．4ml的4%丙三醇溶液，攪拌均勻后，再加入0．25%戊二醛溶液2．4ml，50℃磁力攪拌 30 分鐘。

2．3 載緩釋阿米卡星硅膠導(dǎo)尿管的制作 將經(jīng)過表面預(yù)處理的硅膠管浸入殼聚糖溶液中，室溫下浸泡6小時(shí)。然后，用垂直提拉機(jī)以40mm/min的速率從溶液中提拉出，室溫下干燥10分鐘。取20mg硫酸阿米卡星粉劑，均勻涂覆在硅膠導(dǎo)管上。然后再次將導(dǎo)管放入殼聚糖溶液中，用提拉機(jī)以同樣的速率將導(dǎo)尿管提拉出。室溫下自然干燥。

3 研究方法

3．1 能譜分析 采用1910FE環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM)的能譜分析(EDAX)功能對(duì)膜層的實(shí)際元素組分進(jìn)行檢測，證實(shí)阿米卡星在導(dǎo)尿管上成功負(fù)載。

3．2 藥物釋放規(guī)律研究 將上述制備的載藥涂層的硅膠尿管置于50ml燒杯中，加入50ml PBS溶液，在37℃恒溫下進(jìn)行體外靜態(tài)釋放實(shí)驗(yàn)，每隔一定時(shí)間(最初6小時(shí)，每1小時(shí)取材1次;24小時(shí)后每24小時(shí)取材1次)取5ml溶劑(取材后加入PBS溶液，補(bǔ)足50ml)，用分光光度計(jì)測定吸光度，繪制涂層中阿米卡星的釋放曲線。

3．3 阿米卡星涂層的抗菌活性研究 選用大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC25922)，稀釋成0．5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝唬臃N于M2H平板。將負(fù)載阿米卡星－殼聚糖的尿管、負(fù)載殼聚糖的尿管以及普通尿管直接置于平板上，37℃孵育24小時(shí)后觀察尿管周圍是否有抑菌圈產(chǎn)生。

結(jié) 果

1 負(fù)載阿米卡星-殼聚糖后的導(dǎo)尿管表面肉眼可以白色薄膜層(圖1)

圖1 導(dǎo)尿管樣品大體外觀圖

2 圖2為樣品表面能譜分析圖

圖2a為干燥的普通導(dǎo)尿管的能譜圖，通過分析得知樣品表面主要元素為Si和O，因?yàn)閷?dǎo)管主要材質(zhì)為二氧化硅的水合物(SiO2nH2O)即硅膠。根據(jù)圖2a中的元素含量表知O和Si的含量相當(dāng)。圖2b為負(fù)載阿米卡星-殼聚糖導(dǎo)尿管浸提前的能譜圖。從元素含量表可知O含量比例遠(yuǎn)大于Si，這是因?yàn)橐徊糠盅鮼碓从跉ぞ厶欠肿印Ｍ瑫r(shí)也檢測到S元素，S來源于硫酸阿米卡星，說明藥物成功包埋于殼聚糖膜層中。圖2c為負(fù)載阿米卡星-殼聚糖導(dǎo)尿管浸提后，尿管表面未降解膜層處的能譜圖。圖2d為在PBS溶液中浸泡后的普通導(dǎo)尿管表面的能譜圖，從兩圖的元素含量表中可知導(dǎo)尿管表面含有一定量的Na、Cl和P元素，主要來源于PBS溶液。但是圖2c中Na和Cl含量高于圖2d，這是因?yàn)閷?dǎo)尿管表面尚未降解的殼聚糖膜層可以吸附NaCl，導(dǎo)致其表面Na和Cl含量較普通導(dǎo)尿管增多。

圖2 不同導(dǎo)尿管樣品表面能譜圖

3 體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果

藥物釋放曲線繪制:根據(jù)繪制的硫酸阿米卡星濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到擬合方程:Y=0．162+0．172X(Y為吸光度，X為被測溶液中硫酸阿米卡星濃度)。根據(jù)公式和溶液中吸光度值計(jì)算得到浸提液中硫酸阿米卡星的濃度，繪制成曲線。

圖3中橫坐標(biāo)為浸泡時(shí)間天(d)，縱坐標(biāo)為導(dǎo)尿管涂層中阿米卡星的累計(jì)釋放量。導(dǎo)尿管表面15天釋放阿米卡星量為10mg左右。當(dāng)浸泡時(shí)間為1天時(shí)，導(dǎo)管藥物釋放量均達(dá)到5mg左右，約為載藥量的一半，有一個(gè)突釋過程。當(dāng)5天時(shí)藥物基本釋放速率顯著降低;5～13天釋放曲線較平坦，但是13～15天藥物釋放速率又增加。

圖3 載藥導(dǎo)尿管藥物緩釋曲線(實(shí)際測量曲線)

4 帶涂層導(dǎo)尿管的抗菌活性

將負(fù)載阿米卡星-殼聚糖的導(dǎo)尿管、僅負(fù)載殼聚糖的導(dǎo)尿管以及普通導(dǎo)尿管置于接種0．5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c埃希菌的培養(yǎng)皿中，可見負(fù)載阿米卡星-殼聚糖尿管的周圍有抑菌圈形成，而僅負(fù)載殼聚糖的導(dǎo)尿管以及普通導(dǎo)尿管周圍沒有抑菌圈形成(圖4)，提示阿米卡星-殼聚糖涂層中的阿米卡星保持了抗菌活性。

圖4 導(dǎo)尿管的直接抑菌實(shí)驗(yàn)

討 論

幾乎所有的手術(shù)患者均需要短期留置導(dǎo)尿管。在康復(fù)科、泌尿外科、骨科、神經(jīng)科以及老年科，需要長期留置導(dǎo)尿的頻率很高。CAUTI的感染途徑主要是導(dǎo)尿管腔外感染和導(dǎo)尿管腔內(nèi)感染。CAUTI病原菌的感染途徑主要有，細(xì)菌沿導(dǎo)尿管外壁與尿道黏膜之間細(xì)菌性生物膜而上行(腔外感染途徑);尿管與尿袋導(dǎo)管相連處污染及尿袋出口處污染(腔內(nèi)感染途徑)。由于尿道外口易受尿道分泌物、血跡、糞便污染，同時(shí)污染的衣褲、被褥，均可污染尿道外口周圍黏膜和導(dǎo)尿管，同時(shí)由于每日2次會(huì)陰、尿道外口、導(dǎo)尿管近端消毒只能保持短時(shí)間的相對(duì)無菌，這樣細(xì)菌可以通過污染的尿道外口及導(dǎo)尿管腔外途徑感染［13］，目前眾多研究者認(rèn)為腔外途徑是引起CAUTI的主要環(huán)節(jié)［14］。尿路感染細(xì)菌的生長有兩種方式，一種是在尿液中浮游生長;一種在導(dǎo)管表面生長即生物膜性生長。細(xì)菌入侵并黏附于尿路上皮及導(dǎo)尿管表面，形成細(xì)菌性生物膜及導(dǎo)管的包殼(由細(xì)菌、細(xì)菌代謝物、蛋白質(zhì)組成)，是CAUTI的一個(gè)重要特征，也是CAUTI難治又易復(fù)發(fā)的病理基礎(chǔ)。導(dǎo)管表面的生物膜性包殼，構(gòu)成了保護(hù)細(xì)菌的屏障，阻礙了抗生素對(duì)細(xì)菌的作用［15－16］。CAUTI的發(fā)生與導(dǎo)尿管保留時(shí)間有直接關(guān)系，且尿管留置時(shí)間越長，感染率越高。美國疾病預(yù)防控制中心的一項(xiàng)研究報(bào)告顯示:導(dǎo)尿管留置1天，尿路感染率為1%;留置2天，感染率為5%;留置時(shí)間＞14天，感染率為100%［17］。這與我國多項(xiàng)研究報(bào)告的結(jié)果基本一致。

鑒于CAUTI的常見性、高發(fā)性和難治性，許多的研究投入到感染的預(yù)防工作中。目前臨床預(yù)防和治療CAUTI的主要方法有:(1)盡量減短留置導(dǎo)尿管的時(shí)間。但是，拔除尿管后，需要每日進(jìn)行間斷清潔導(dǎo)尿4～6次，明顯增加醫(yī)療成本，增加護(hù)理工作量。同時(shí)反復(fù)導(dǎo)尿?qū)δ虻赖拇碳ぃ浅Ｈ菀自斐赡虻罁p傷，增加尿道攣縮、梗阻和菌血癥的風(fēng)險(xiǎn)。(2)留置尿管后增加飲水量，每日進(jìn)行膀胱沖洗，定期更換尿管。(3)對(duì)于已經(jīng)發(fā)生的CAUTI，無排尿功能障礙的患者，在拔除尿管后常規(guī)抗感染治療即可。但是對(duì)于存在排尿功能障礙的截癱患者，尤其是存在膀胱感覺功能障礙的患者，在全身大劑量使用抗生素的同時(shí)是否拔除尿管是個(gè)困難的抉擇。一種觀點(diǎn)認(rèn)為，拔除尿管，拔除膀胱和尿道中的異物，可以有效防止致病菌在異物表面的黏附，對(duì)控制感染是有效的。拔除尿管后用間斷清潔導(dǎo)尿的方法排出尿液。但是因反復(fù)導(dǎo)尿，容易造成尿道損傷，有導(dǎo)致致病菌入血，發(fā)生菌血癥的風(fēng)險(xiǎn)。另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，繼續(xù)留置尿管，可以使致病菌的培養(yǎng)基－尿液及時(shí)排出，同時(shí)便于膀胱沖洗，避免尿路損傷。但是留置在膀胱和尿道內(nèi)的尿管，也便于致病菌的附著，容易形成生物膜，導(dǎo)致藥物治療失敗。究竟孰優(yōu)孰劣，目前還沒有定論。最新的研究資料表明，在拔出尿管前預(yù)防性使用抗生素可以有效減少尿管拔出后尿路感染的發(fā)生率。如何正確有效的預(yù)防和治療CAUTI，尤其是多重耐藥致病菌所致的CAUTI仍然是目前臨床醫(yī)學(xué)所面臨的迫切需要解決的非常重要的問題。

導(dǎo)尿管對(duì)人體是異物，當(dāng)插入尿道并長期留置于尿道及膀胱內(nèi)后，會(huì)刺激尿道及膀胱黏膜，破壞正常的生理環(huán)境，削弱尿道及膀胱對(duì)細(xì)菌的防御作用［18］，影響膀胱對(duì)細(xì)菌的正常沖刷作用。尿道內(nèi)細(xì)菌的存留易引起尿路感染，減少尿道中的細(xì)菌，可以減少尿路感染的發(fā)生。盛暉等［19］設(shè)計(jì)制作了一種帶Y形管的引流裝置，通過該裝置將苯扎溴銨溶液注入引流裝置內(nèi)，達(dá)到殺滅引流管內(nèi)存在細(xì)菌的目的。經(jīng)臨床應(yīng)用有效地控制了留置導(dǎo)尿管后的逆行尿路感染。帶有抗菌素膜層的導(dǎo)尿管，由于膜層中的抗菌素可以逐漸釋放，殺滅尿管周圍的細(xì)菌，降低尿液中細(xì)菌的濃度，減少細(xì)菌在尿管壁上的黏附，從而減少生物膜的形成，最終達(dá)到減少CAUTI發(fā)生的目的。

在本研究中，我們采用殼聚糖為載體，將阿米卡星成功附著在硅橡膠導(dǎo)尿管的表面。殼聚糖本身可以降解成二氧化碳和水，是一種已經(jīng)被批準(zhǔn)用于人體的高分子材料。尿路感染的流行病學(xué)調(diào)查顯示，阿米卡星仍然對(duì)CAUTI的主要致病菌大腸埃希菌等保持較高的敏感度，且阿米卡星抗菌譜廣、不易誘導(dǎo)耐藥且價(jià)格低廉，非常適用于局部使用。結(jié)果顯示，我們所采用的方法沒有破壞阿米卡星的抗菌性能，且阿米卡星逐漸從涂層內(nèi)釋放，抗菌效果維持一定長的時(shí)間。在13～15天藥物釋放速率增加，我們考慮與尿管表面本身對(duì)涂層的黏附性能有關(guān)。在制作過程中，我們采用兩次涂膜的方法。肉眼觀察，第一次涂膜后，尿管表面膜層均勻，光澤度好。但是第二次涂膜后，尿管表面的光澤度降低。不同的涂膜次數(shù)對(duì)涂層釋放的影響還需要進(jìn)一步研究。

本研究中所采用的制作方法可以用于制作載緩釋阿米卡星－復(fù)方殼聚糖硅膠導(dǎo)尿管。該尿管在體外可以緩釋有抗菌活性的阿米卡星。但是，導(dǎo)尿是引起醫(yī)院尿路感染的直接因素，CAUTI的主要致病因素是導(dǎo)尿管與尿道間隙細(xì)菌逆行感染以及其它腔內(nèi)感染途徑，且感染發(fā)生與留置時(shí)間長短成正比。因此在臨床上使用導(dǎo)尿管要有臨床適應(yīng)癥狀，同時(shí)應(yīng)盡早拔出尿管行間斷清潔導(dǎo)尿，盡量減少留置尿管造成的感染。在臨床上對(duì)導(dǎo)尿管的材質(zhì)及涂層改進(jìn)，阻止細(xì)菌生長及細(xì)菌生物膜的形成，從而有效地降低必須留置尿管患者CAUTI的發(fā)生率，從而減少抗生素的使用，最終可以降低由此導(dǎo)致的抗生素耐藥性的發(fā)生。

［1］邢玉斌，呂增春，朱士俊，等．醫(yī)院感染現(xiàn)患率調(diào)查報(bào)告［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2000，10(4):263 －265．

［2］ FoxmanB．Epidemiology of urinary tract infections:incidence，morbidity and economic costs［J］．Am J Med，2002，113(S1A):5－13．

［3］中野博．導(dǎo)尿引起的感染及其預(yù)防管理［J］．國外醫(yī)學(xué)醫(yī)院管理分冊，1989，6(2):71．

［4］史清秀，韋真理，陳柳紅．留置導(dǎo)尿管尿路感染的研究［J］．護(hù)士進(jìn)修雜志，2000，15(8):592 －593．

［5］鐘惟德．留置導(dǎo)尿管致尿路感染病原菌分布［J］．中華醫(yī)現(xiàn)感染學(xué)雜志，2001，11(6):471 －473．

［6］黃梅花，徐萬華，陳運(yùn)生．留置導(dǎo)尿管致尿路細(xì)菌感染的臨床研究［J］．齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，26(8):877－878．

［7］高磊，朱燕，肖永紅．Mohnarin2008年度報(bào)告:男/女性尿標(biāo)本細(xì)菌耐藥監(jiān)測研究［J］．中國抗生素雜志，2010，35(8):633－639．

［8］陳慧紅，韓立中，余素飛，等．大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌超廣譜β－內(nèi)酰胺酶基因型研究［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18(2):160 －162．

［9］陳淑蘭，路娟，宋熙瑤，等．常見非發(fā)酵菌的臨床分布與耐藥性分析［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18(4):589－591．

［10］王輝，陳民鈞，倪語星，等．2003－2004年中國十家教學(xué)醫(yī)院革蘭陰性桿菌的耐藥分析［J］．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，28(12):1295 －1303．

［11］ Liedberg H，Lundeberg T，EkmanP．Refinements inthe coating of urethral catheters reduce the incidence of catheter－associated bacteriuria:anexperimental and clinical study［J］．Eur Urol，1990，17(3):236 －240．

［12］ Maki DG，Knasinski V，HalvorsonK，et al．A novel silverhydrogel impregnated indwelling catheter reduces CAUTIs:a prospective double－blind trial//Programs and abstracts of the Society for Healthcare Epidemiology inA-merica Annual Meeting［C］．Orlando，F(xiàn)lorida，1998．

［13］ Maki DG，Knasinski V，Tambyah PA．Risk factors for catheter associated urinary tract infection:a prospective study showing the minimal effects of catheter care violations onthe risk of CAUTI［J］．Infect Control Hosp Epidemiol，2000，21:165．

［14］王菊延，張善芳，陳汝純，等．復(fù)方阿米卡星凝膠預(yù)防留置尿管逆行感染的研究［J］．護(hù)理學(xué)雜志，2001，16(9):515－517．

［15］ Trautner BM，Darouiche RO．Role of biofilm incatheteassociated urinary tract infection［J］．Am J Infect Control，2004，32(3):177 －183．

［16］容桂榮．留置尿管伴隨性尿路感染相關(guān)因素研究進(jìn)展［J］．華夏醫(yī)學(xué)，2002，15(5):703 －704．

［17］鐘秀玲，李小瑛，羅艷霞，等．醫(yī)院泌尿系感染危險(xiǎn)因素分析與對(duì)策［J］．南方護(hù)理學(xué)報(bào)，2002，9(1):8 －9．

［18］胡美春．留置導(dǎo)尿患者尿路感染的原因分析及預(yù)防措施［J］．中華護(hù)理雜志，2003，38(8):645 －647．

［19］盛暉，鐘云萍，劉瑛．Y形引流裝置控制留置導(dǎo)尿管逆行尿路感染［J］．中華國際醫(yī)學(xué)雜志，2001，1(6－7):568－569．